一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>掌握堿法小量提取質(zhì)粒DNA。
二、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
質(zhì)粒DNA的小量提取。
三、 實(shí)驗(yàn)原理
所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，將質(zhì)粒DNA釋放到上清液中。堿性溶劑使堿基配對(duì)完全被破壞，閉環(huán)質(zhì)粒DNA雙鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，重新形成完全天然地超螺旋結(jié)構(gòu)。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，與PDS一起沉淀。離心除去變性劑，從上清液中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
四、 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
㈠細(xì)菌培養(yǎng)和收集
將帶有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌接種在LB固體培養(yǎng)基（含100μg/ml Amp）中，37℃培養(yǎng)12～24小時(shí)。在超凈工作臺(tái)中用無菌的牙簽挑取平板培養(yǎng)基上的單菌落接種到25ml LB液體培養(yǎng)基（含100μg/ml Amp）中，37℃振蕩培養(yǎng)（220rpm）約18小時(shí)至對(duì)數(shù)生長后期（OD600=0.6）。
㈡堿法小量提取質(zhì)粒DNA
1、 將菌液倒入1.5ml的微量離心管中，于4℃12000rpm離心30秒，棄去上清液，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。重復(fù)3次，以得到較多的細(xì)菌沉淀（視具體情況而定）。
2、 將微量離心管開口倒置在衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡。
3、 加入100μl用冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩，將沉淀徹底懸浮，然后室溫放置5分鐘。
4、 加入200μl現(xiàn)配的溶液II，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管（不要振蕩，以避免DNA斷裂），使混合物混勻，冰浴2～5分鐘。
5、 加入150μl預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，溫和顛倒混勻，使粘稠地細(xì)菌裂解物均勻地分布于溶液III中，冰浴2～5分鐘。
6、 4℃,12000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入另一只1.5ml離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10分鐘。
7、 4℃，12000rpm離心10分鐘。棄去上清液，在沉淀中加入TE緩沖液500μl，充分溶解。
8、 加入等體積氯仿：異戊醇（24︰1），上下顛倒混勻約30次。4℃，12000rpm離心10分鐘。
9、 取上部水相，移入新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（也可同時(shí)加入1/10倍體積的醋酸鈉），震蕩混勻，室溫放置10分鐘沉淀雙鏈DNA，然后4℃，12000rpm離心10min。
10、 棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡后，加 入預(yù)冷的1ml 70％乙醇。
11、棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡，置DNA濃縮干燥儀中干燥5～10分鐘。
12、將沉淀溶于30μl TE緩沖液，置－20℃保存?zhèn)溆谩?br>
五、 場地、設(shè)備與器材
微量移液器，微量離心管(eppendorf管)，離心管架、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫振蕩搖床、渦旋振蕩器、電泳儀、瓊脂糖平板電泳槽、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、DNA濃縮干燥儀。
聯(lián)系客服
