定向進化（directed evolution），是指在實驗室的特定條件下對自然進化的模擬和改進。
2018 年，因為其在 “酶的定向進化” 領域上所做出的貢獻，弗朗西斯?阿諾德（Frances H. Arnold）教授摘得了當年的諾貝爾化學獎。正如獲獎理由中所說那樣：這項技術（定向進化）幫助了科學家們 “掌控了進化的力量 ”。
圖丨 2018 年諾貝爾化學獎得主（來源：Nobel Prize）在自然過程中，物種的繁殖會伴隨有少數(shù)隨機產生的變異，一旦生存環(huán)境發(fā)生改變，而變異者比非變異者更適應這種變化的話，那么它們將會 “被環(huán)境選擇” 而得以存活，從而實現(xiàn)了物種的進化。與之類似，要在定向進化過程中復現(xiàn)這一過程，首先便是在目標蛋白的基因水平上盡可能多地人為誘發(fā)突變，形成一個龐大的基因突變庫，然后進行表達，得到相應的突變庫。最終，只有符合研究人員需求的具有特定性質的突變體會 “脫穎而出”。值得關注的是，定向進化技術能使基因突變更迅速，后續(xù)選擇更高效，這樣可以讓蛋白質盡快達到預期的表現(xiàn)形式或者功能狀態(tài)。如今，科學家們已借助 “試管里的達爾文進化論” 得到了性能優(yōu)化的酶、熒光蛋白、離子通道、抗體等等。定向進化技術發(fā)展前期，大多致力于改造酶的特異性、穩(wěn)定性、催化活性等等，服務于能源化工領域，因此在試管里或者細菌酵母里完成定向進化。然而，通過此類技術路線得到的蛋白質，在應用到生物學和醫(yī)學領域時，往往無法達到預期效果。此外，在非哺乳動物細胞環(huán)境下進化得到的蛋白質，常常會因錯誤的折疊修飾、分子間相互作用、錯誤的細胞定位等因素，使之無法在復雜的哺乳動物細胞中正常工作。因此，開發(fā)能夠應用于哺乳動物細胞中的定向進化技術，便是一大趨勢。而就在 4 月 7 日，來自 MIT 化學系的 Samuel J. Hendel 和 Matthew D. Shoulders 副教授在 Nature Methods 發(fā)表了相關綜述，對在哺乳動物細胞中實現(xiàn)定向進化的研究進展和困難挑戰(zhàn)進行了梳理。圖丨 適用于哺乳動物細胞的定向進化（圖源：Nature Methods）要完成一輪定向進化，通常需要分為三步：“突變”、“表達” 以及 “篩選或選擇”。第一步便是構建目的基因的突變庫。人工引入突變的方法一般分為細胞外突變法（ex mammalia mutagenesis）和細胞內突變法（in mammalia mutagenesis）。圖丨 典型的突變法（圖源：Nature Methods）細胞外突變法主要包括：可以產生隨機突變的的易錯 PCR（error-prone PCR）和易突變菌株（mutator strains of bacteria），以及可以產生非隨機突變的定點突變（site-directed mutagenesis）和合成文庫（synthetic library generation）。細胞內突變法主要包括：體細胞超突變（somatic hypermutation）、基于 CRISPR 的定點突變（CRISPR-based DNA targeting）、基于 RNA 聚合酶的持續(xù)突變（ highly processive RNA polymerases）和病毒輔助的突變（viral replication）。突變是發(fā)生在基因層面上的，而篩選或選擇需要通過表型進行，因此便需要一個中間環(huán)節(jié)將兩者聯(lián)系起來，那便是：“表達”。通常研究人員建立基因突變文庫后，需要先在細胞內瞬時地或者穩(wěn)定地表達生成蛋白質，才能夠進行下一步的挑選和驗證。圖丨 典型的表達法（圖源：Nature Methods）瞬時表達法中，包括化學轉染法和電轉染法，轉染效率、細胞間不一致的表達水平、多突變體在一個細胞中表達和細胞系兼容性，都是干擾實驗的因素。穩(wěn)定表達法中，包括逆轉錄病毒轉導法（retroviral transduction）和定點重組法（site-specific recombination），解決了前者存在的一些干擾因素，尤其能基本保障細胞間表達水平一致。最后一步，便是研究人員對細胞內表達的突變體進行評估，挑選出符合目標功能需求的進化突變體。在挑選過程中，有著兩種策略：一種是篩選（screening），另一種是選擇（selection）。二者的區(qū)別在于，篩選通常以物理性質為判斷依據（例如光學性質），而選擇通常以生物表型為判斷依據（例如細胞活性）。圖丨 典型的篩選法和選擇法（圖源：Nature Methods）在篩選法中，研究人員會給目的蛋白的功能設定一個閾值，然后通過熒光流式細胞術（fluorescence-based flow cytometry）或細胞顯示法（cellular display），機械性地分離出高出閾值的、具備理想突變體的細胞。而在選擇法中，研究人員會設計合理的細胞調控回路，使得目的蛋白定向進化出的功能，能顯著影響細胞存活的必要因素。隨后人為施加生存環(huán)境上的選擇壓力，使得只有具備特定性質的 “適合環(huán)境” 的突變體才能夠存活。篩選法需要研究人員手動處理每輪定向進化之前、之中和之后的細胞，以及確定每一輪的篩選閾值，人力成本較高。相比之下，選擇法對人員和設備的要求更低、更易于實現(xiàn)規(guī)?；投啻蔚?。自定向進化技術問世以來，已經衍生出相當多的細分技術。在各類技術之中，可控制、高效率的突變一直是定向進化的核心關鍵。正如前文所述，在哺乳細胞中的突變方法通?？梢苑譃閮深悾杭毎馔蛔兎ê图毎麅韧蛔兎?。而在細胞內突變法之中，新興的病毒輔助方法則進一步拓展了定向進化的應用范圍。細胞外突變法是最為成熟且直觀的定向進化方法，通過該方法與不同種類的篩選方法的聯(lián)用，研究人員已經成功進化出了許多有價值的蛋白質，比如：不穩(wěn)定結構域、離子通道及致癌蛋白等等。圖丨 利用細胞外突變法實現(xiàn)定向進化的例子（圖源：Nature Methods）利用細胞外突變結合篩選法，可以進化出能被特異性小分子配體調控的不穩(wěn)定結構域，那是一種控制功能性蛋白的穩(wěn)定性的分子工具。而如果使用其結合選擇法的話，則通常被用于闡明致癌蛋白是如何產生耐藥性的。雖然細胞外突變法成熟且直觀，不過其存在著嚴重的缺陷：由于突變庫的表達和提取需要密集的人工操作，在大多數(shù)情況下，細胞外突變法只能在相當有限的突變庫上進行一輪進化。然而，為了得到更有優(yōu)勢的蛋白質，或者達成更復雜的定向進化目標，就需要更大體量的突變庫以及執(zhí)行多輪迭代的進化。圖丨 可迭代的定向進化示意圖（圖源：Nature Methods）近五年里，研究人員們致力于突破這個瓶頸，開發(fā)了細胞內突變法。相較于微生物，在哺乳動物細胞里進行細胞內突變法顯然更具挑戰(zhàn)性。哺乳動物細胞基因組規(guī)模巨大，這意味著，更容易發(fā)生一些能欺騙篩選或選擇策略的脫靶突變。為了更加快速、高效、準確地實現(xiàn)細胞內的連續(xù)進化，研究人員們不斷對目前已有的細胞內突變法進行優(yōu)化和改進。圖丨 利用細胞內突變法實現(xiàn)定向進化的例子（圖源：Nature Methods）目前在細胞內突變法中，常用的誘發(fā)突變的分子工具是脫氨酶。活化誘導的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID)，能將胞嘧啶脫氨轉化為尿嘧啶。由此產生的尿嘧啶，可能被錯誤修復，也可能在復制時錯誤與腺嘌呤而不是鳥嘌呤結合，因而誘發(fā)突變。基于此，研究人員實現(xiàn)了對哺乳動物細胞中的抗體和熒光蛋白的定向進化。可惜的是，AID 并非只作用于特定基因位點，而是會普遍地在高轉錄區(qū)域誘導基因突變。那么，我們就需要給 “激光” 裝上 “定位系統(tǒng)”。現(xiàn)有的 “定位系統(tǒng)” 主要是 Cas 酶和 T7 RNA 聚合酶。Cas9 可在向導 RNA（guide RNA）的引導下靶向切割基因組位點。進行切割以后，細胞會以兩種機制修復此位點，非同源末端連接（Non-homologous End Joining）或者同源定向修復（Homology directed repair），誘發(fā)突變。基于此，研究人員得到了具有耐藥性突變的蛋白，和在低 pH 環(huán)境的溶酶體中也能維持生理活性的熒光蛋白。新興的 CRISPR 工具誠然實現(xiàn)了定點引入突變的突破，但是，如果想要實現(xiàn)多輪迭代的進化，就需要能識別積累了多次突變的位點的 gRNA。此外，該技術仍然受到切割位點范圍的限制，僅在 gRNA 互補區(qū)附近 (~10–50?bp) ，而目的基因不一定具備足夠多的合適位點。為了解決突變窗口小這一問題，研究人員引入了和 Cas9 同樣具備靶向能力的，而且定位范圍更廣的 RNA 聚合酶。T7 RNA 聚合酶（T7 RNA polymerase）識別特異性的 T7 啟動子后，并且能夠覆蓋超過 10000 bp 的 DNA。研究人員結合 T7 RNA 聚合酶與胞苷脫氨酶（cytidine deaminase），開發(fā)了 TRACE (T7 polymerase-driven continuous editing) 系統(tǒng)，實現(xiàn)特定基因的哺乳動物細胞內連續(xù)進化。利用 TRACE，研究人員已篩選出在 A375 細胞中對小分子抑制劑具有抗藥性的 MEK 變種。從理論上講，現(xiàn)在可以很容易地將 RNA 引導的核酸內切酶或 T7 聚合酶直接在哺乳動物細胞中瞄準的任何基因變異。盡管如此，上述方法仍受到諸多因素的制約。首先，哺乳動物細胞生長速度緩慢。其次，細胞能自發(fā)通過其他旁路途徑獲得對選擇壓力的抵抗力。再者，上述方法只關注了優(yōu)化建立突變庫的策略，而仍然依賴于傳統(tǒng)的選擇或篩選方法，可選擇的具備可觀察的表型或與細胞活性相關的生物分子的范圍較為狹窄。而最近開發(fā)的病毒輔助定向進化平臺，克服了上述基于細胞的方法的許多局限性，使得可以通過定向進化來實現(xiàn)功能優(yōu)化的生物分子的范圍大大擴大。病毒輔助定向進化的概念很簡單：將感興趣的基因引入病毒的基因組中，然后將病毒在細胞中繁殖的能力與定向進化目標蛋白的功能聯(lián)系在一起，病毒以低保真度復制。這就意味著，那些產生符合需求的突變的病毒，大量繁殖，成為優(yōu)勢群體。在開發(fā)適用于哺乳動物細胞的病毒輔助定向進化技術時，研究人員需要考慮的一般原則包括：病毒的復制速度不能超過目的基因的表達速度，盡量選擇宿主廣泛的病毒，以及病毒生產包裝的實用性和在實驗室操作的安全性。兩個里程碑式的工作，極大促進了病毒輔助定向進化的發(fā)展。一個是 Matthew D. Shoulders 實驗室在 2018 年開發(fā)的適用于哺乳動物的噬菌體輔助連續(xù)進化系統(tǒng)（mammalian Phage-Assisted Continuous Evolution，mPACE），另一個是 Bryan L. Ruth 實驗室在 2019 年開發(fā)的基于病毒的精準序列進化系統(tǒng)（viral evolution of genetically actuating sequences，VEGAS）。圖丨病毒輔助定向進化的設計流程圖（圖源：Nature Methods）mPACE 和 VEGAS 的基本原理相近：首先，刪除病毒基因組里的對于病毒生存必須的基因，同時引入感興趣的目的基因；接著，改造宿主哺乳動物細胞的基因組，把想要進得到的目的基因的功能與原本缺失的病毒基因的轉錄、翻譯或激活，偶聯(lián)在一起。這樣一來，只有進化出我們感興趣功能的病毒突變株，才能被分泌到細胞外，感染新的細胞并進行下一輪復制增殖，數(shù)量增多，從而在進化池中保留下來，實現(xiàn)了生物體 “自發(fā)” 的連續(xù)定向進化。相比于其它技術，病毒輔助定向進化技術可謂是取得了重大突破。其顯著優(yōu)勢體現(xiàn)在速度快，人力勞動成本低 ，避免了哺乳動物基因組中脫靶突變的積累，以病毒豐度為選擇依據，為更多目的蛋白的進化提供可能。它能提供最大的突變庫和最短的實驗時間尺度，原則上允許最廣泛的生物分子進化，極大地幫助研究人員獲得更豐富的更理想的蛋白質。總結來說，目前在哺乳動物之中成功進化的蛋白質大致分為三類：參與細胞保守的生理過程、多細胞生物特有的生理過程、或者哺乳動物特有的生理過程，很顯然，基于哺乳動物細胞的定向進化技術對于研究和改造這三類蛋白是必不可少的。圖丨通過定向進化得到的適用于哺乳動物細胞的蛋白進展總結（圖源：Nature Methods）通過在實驗室模擬并加速自然的進化過程，我們不僅可以針對某目標蛋白進行改造，還可以優(yōu)化細胞代謝網絡、獲得期望表型的細胞，為合成生物學開發(fā)更豐富更精確的功能元件、設計組裝系統(tǒng)提供了強有力的工具。定向進化技術，在工業(yè)生產、臨床醫(yī)學和基礎科研方面都蘊藏著巨大的潛力。我們可以通過定向進化，獲得性能優(yōu)異的蛋白質，應用于能源、化工、醫(yī)療等領域。通過對定向進化結果的分析，我們也更深刻地探索蛋白質從序列到結構到功能間的微妙關系。“適者生存沒有一定之規(guī)，只有保持變化才是生命的長青之道?！?隨著定向進化技術變得更加高效和普適，研究人員在運用進化的力量上，愈發(fā)得心應手。論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41592-021-01090-x
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編輯/汪琳
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