臨床ELISA測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F(xiàn)分述如下。
一、臨床標(biāo)本的收集和保存 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清（漿），有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前臨床上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測(cè)定此類(lèi)激素時(shí)，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測(cè)定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的最適時(shí)間抽血檢測(cè)。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：
（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
（3）血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下。 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。
(5）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。
二、試劑準(zhǔn)備
在臨床實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿(mǎn)足測(cè)定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以OPD為底物時(shí)，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制。
三、加血清樣本及反應(yīng)試劑 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。
四、溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是臨床ELISA測(cè)定中最容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。通常目前國(guó)內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘～1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時(shí)才能有較完全的結(jié)合，低于1小時(shí)，可能會(huì)影響測(cè)定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：
（1）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)，而在臨床實(shí)驗(yàn)室中，很少有人注意這個(gè)問(wèn)題，通常是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問(wèn)題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個(gè)問(wèn)題，就是在每一年的冬季總有那么一個(gè)多月的時(shí)間，在做HBsAg測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控中，測(cè)定由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng)的1 ng/ml弱陽(yáng)性樣本時(shí)，總是測(cè)不出來(lái)，不知原因?yàn)楹?？這可能就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠，以致弱陽(yáng)性樣本測(cè)定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長(zhǎng)板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測(cè)量觀察即可。 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時(shí)，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測(cè)定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來(lái)看，在較低的溫度下反應(yīng)較長(zhǎng)的時(shí)間最為完全。如2～8℃下反應(yīng)24小時(shí)。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動(dòng)的加憐惜，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對(duì)分子含量較多的強(qiáng)陽(yáng)性樣本的測(cè)定沒(méi)有問(wèn)題，但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測(cè)定中盡量使用較低溫育溫度較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件。
（3）“邊緣效應(yīng)”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同。但有研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。
總而言之，在臨床ELISA測(cè)定中，要保證好的測(cè)定效果，可采用下述簡(jiǎn)單辦法來(lái)確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?，放于溫箱中，這樣就會(huì)因?yàn)榘鍡l孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。
五、洗板 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。因此，洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其在洗滌中的作用機(jī)理是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動(dòng)吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動(dòng)吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測(cè)定下限。
在臨床實(shí)驗(yàn)室中，ELISA測(cè)定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。手工洗板即是在每次反應(yīng)溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后在板孔中加滿(mǎn)洗液，放置2～3分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復(fù)上述洗滌步驟3～4次，最后在吸水紙上拍干，即可進(jìn)行下一步測(cè)定操作。洗板機(jī)洗板則是將上述手工操作改由洗板機(jī)進(jìn)行，使用洗板機(jī)洗板的一個(gè)特點(diǎn)是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機(jī)洗板至徹底所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機(jī)。在特定臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的洗板機(jī)，到底洗多少次能達(dá)到要求，可進(jìn)行下面這個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)：選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每2×8孔分別加入相同一份弱陽(yáng)性和一份陰性樣本，按試劑盒說(shuō)明加入酶結(jié)合物并完成溫育后，洗板孔時(shí)按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測(cè)定，如洗3次后，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測(cè)定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽(yáng)性/陰性值保持最大不變，則可以認(rèn)定該實(shí)驗(yàn)室所用洗板機(jī)3次洗板即可達(dá)到要求。
六、顯色
在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30分鐘。從理論上說(shuō)，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30分鐘后，終止反應(yīng)比色測(cè)定。
此外，在加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。以OPD為底物，配好后應(yīng)為無(wú)色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個(gè)顯色反應(yīng)過(guò)程無(wú)需避光，而以OPD為底物，則需避光進(jìn)行。關(guān)于TMB和OPD的顯色反應(yīng)特點(diǎn)及注意點(diǎn)可參考前面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定或肉眼判斷結(jié)果。
七、比色 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行，有的同行可能會(huì)認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時(shí)便可以萬(wàn)事大吉了，其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為先進(jìn)的酶標(biāo)儀器儀表，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會(huì)得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測(cè)定后，有許多陰性測(cè)定孔的吸光度值為負(fù)數(shù)或測(cè)定假陽(yáng)性率大大增加等等。這主要是沒(méi)有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。至于如何正確理解和使用酶標(biāo)儀詳見(jiàn)后面有關(guān)章節(jié)。此處，只是強(qiáng)調(diào)下面兩點(diǎn)：
（1）比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。
（2）單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)比色功能。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長(zhǎng)比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測(cè)定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。
八、結(jié)果判定 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
臨床ELISA測(cè)定按其表示測(cè)定結(jié)果的方式分為定性和定量測(cè)定兩大類(lèi)。定性測(cè)定只是對(duì)標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的結(jié)論，分別用“陽(yáng)性”和“陰性”來(lái)表示。可見(jiàn)定性測(cè)定通常是用于傳染性病原體的抗原或抗體的測(cè)定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測(cè)定則是對(duì)標(biāo)本中待測(cè)抗原的多少進(jìn)行量值測(cè)定，以具體數(shù)值表示。定量測(cè)定基本上是用于非病原體抗原物質(zhì)的測(cè)定，如激素、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、小分子藥物等。目前國(guó)內(nèi)在臨床上應(yīng)用的ELISA試劑盒絕大部份是用于傳染性病原體的抗原或抗體的定性測(cè)定，也有少部份用于αFP、hCG、細(xì)胞因子等的定量測(cè)定。ELISA定性測(cè)定的“陽(yáng)性”和“陽(yáng)性”的判定依據(jù)是試劑盒所確定的陽(yáng)性判定值（Cut-off）。定量測(cè)定的“量值”依據(jù)是試劑盒中所帶標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)測(cè)定得出的劑量反應(yīng)曲線（又稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線）。有關(guān)ELISA定性和定量測(cè)定結(jié)果的數(shù)據(jù)處理后面將有專(zhuān)門(mén)章節(jié)討論。本處只想強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，ELISA定性測(cè)定的“陰性”和“陽(yáng)性”結(jié)果的判定依據(jù)只能是試劑盒本身所確定的Cut-off值，而不能以衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng)弱陽(yáng)性定值質(zhì)控血清。為什么要強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)呢？主要是因?yàn)橐郧坝泻芏嗷鶎訉?shí)驗(yàn)室均使用部中心供應(yīng)的弱陽(yáng)性定值質(zhì)控血清（以前也稱(chēng)“臨界值”血清）的測(cè)定吸光度來(lái)判定結(jié)果，高于其判為陽(yáng)性，反之為陰性，而不管試劑盒Cut-off值為何。到目前為止，仍有一些實(shí)驗(yàn)室在堅(jiān)持這種錯(cuò)誤的做法。試劑盒的Cut-off值的設(shè)立是建立在一系列科學(xué)試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)研究的基礎(chǔ)上的（詳見(jiàn)后述），而部中心供應(yīng)的弱陽(yáng)性定值質(zhì)控血清主要是供臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控時(shí)使用。
下面再解釋一下在ELISA定性測(cè)定結(jié)果判定中常用的一些縮寫(xiě)。
（1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標(biāo)本)的簡(jiǎn)寫(xiě)，表示的是標(biāo)本測(cè)定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡(jiǎn)寫(xiě)。除競(jìng)爭(zhēng)抑制法外，其它ELISA定性測(cè)定模式中，當(dāng)S/CO值大于或等于1時(shí)，標(biāo)本的測(cè)定為陽(yáng)性，小于1時(shí)為陰性。
（2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對(duì)照)的簡(jiǎn)寫(xiě)，P為Patient（患者）的簡(jiǎn)寫(xiě)。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無(wú)根本性區(qū)別，只不過(guò)是前者將陰性對(duì)照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。
九、結(jié)果報(bào)告及解釋 本文轉(zhuǎn)載自生物秀 www.bbioo.com
臨床ELISA測(cè)定結(jié)果的報(bào)告較為簡(jiǎn)單。定性測(cè)定報(bào)陰性或陽(yáng)性即可；定量測(cè)定則報(bào)出具體的數(shù)值。結(jié)果解釋比較起來(lái)要復(fù)雜的多，它要求實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員對(duì)所測(cè)定的項(xiàng)目有較為全面的知識(shí)基礎(chǔ)。例如，對(duì)乙肝“兩對(duì)半”結(jié)果的解釋?zhuān)坏髾z驗(yàn)者要知道不同的結(jié)果模式的臨床意義，而且必須對(duì)乙肝病毒的分子生物學(xué)、分子的變異及其對(duì)表型的影響有更深層次的了解?，F(xiàn)在，檢驗(yàn)不再是單純的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，而已成為一門(mén)臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科，即檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，這就要求從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作的檢驗(yàn)醫(yī)師，對(duì)所做的測(cè)定項(xiàng)目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時(shí)代所淘汰。
綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因，特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)于下表。
臨床ELISA測(cè)定中可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題及可能的原因
問(wèn) 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因）
1．弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出 溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題
2．測(cè)定的重復(fù)性差 （相同樣本兩次測(cè)定結(jié)果不一致） 這是典型的由測(cè)定操作引起的問(wèn)題，包括
（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；
（2）加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；
（3）加錯(cuò)樣本；
（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；
（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；
（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；
（7）孔內(nèi)污染雜物；
（8）酶標(biāo)儀濾光片不正確；
（9）血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。
3．白板
（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）
（1）漏加酶結(jié)合物；
（2）洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。
（3）漏加顯色劑A或B；
（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。
4．全部板孔均有顯色
（1）洗板不干凈；
（2）顯色液變質(zhì)；
（3）加底物的吸光受酶污染；
（4）洗板液受酶等污染。
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