陳華友，崔振玲（上海200062華東師范大學(xué)生物系分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）
摘要：基因芯片技術(shù)是90年代中期以來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué)。其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法，將大量DNA探針片段有序地固化予支持物的表面，然后與已標(biāo)記的生物樣品中DNA分子雜交，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，就可得出該樣品的遺傳信息。基因芯片技術(shù)目前國(guó)內(nèi)外都取得了較大的進(jìn)展，該技術(shù)可用于DNA測(cè)序，基因表達(dá)及基因組圖的研究，基因診斷，新基因的發(fā)現(xiàn)，藥物篩選，給藥個(gè)性化等等，所以為二十一世紀(jì)生物醫(yī)藥鋪平道路，將為整個(gè)人類社會(huì)帶來深刻廣泛的變革，促進(jìn)人類早日進(jìn)入生物信息時(shí)代。
關(guān)鍵詞：基因芯片；微陣列；基因診斷；藥物篩選
生物芯片技術(shù)是隨著"人類基因組計(jì)劃"（human genome project, HGP）的進(jìn)展而發(fā)展起來的，它是90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，它融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片（1）。本文主要討論基因芯片技術(shù)，它為"后基因組計(jì)劃"時(shí)期基因功能的研究提供了強(qiáng)有力的工具，將會(huì)使基因診斷、藥物篩選、給藥個(gè)性化等方面取得重大突破，該技術(shù)被評(píng)為1998年度世界十大科技進(jìn)展之一。
1 基本概念
基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或顯微打印手段，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)。
2 技術(shù)基本過程
2．1 DNA方陣的構(gòu)建
選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物，并作相應(yīng)處理，然后采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)可在硅片等表面合成寡核苷酸探針;（2）或者通過液相化學(xué)合成寡核苷酸鏈探針，或PCR技術(shù)擴(kuò)增基因序列，再純化、定量分析，由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device ARD），或陣列機(jī)（arrayer）及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片（3）。
2．2 樣品DNA或mRNA的準(zhǔn)備。
從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標(biāo)記成為探針以前必須進(jìn)行擴(kuò)增提高閱讀靈敏度。Mosaic Technologies公司發(fā)展了一種固相PCR系統(tǒng)，好于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，他們?cè)诎蠨NA上設(shè)計(jì)一對(duì)雙向引物，將其排列在丙烯酰胺薄膜上，這種方法無交叉污染且省去液相處理的繁鎖；Lynx Therapeutics公司提出另一個(gè)革新的方法，即大規(guī)模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）這個(gè)方法可以對(duì)一個(gè)樣品中數(shù)以萬計(jì)的DNA片段同時(shí)進(jìn)行克隆，且不必分離和單獨(dú)處理每個(gè)克隆，使樣品擴(kuò)增更為有效快速（4）。
在PCR擴(kuò)增過程中，必須同時(shí)進(jìn)行樣品標(biāo)記，標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法等。
2．3 分子雜交
樣品DNA與探針DNA互補(bǔ)雜交要根據(jù)探針的類型和長(zhǎng)度以及芯片的應(yīng)用來選擇、優(yōu)化雜交條件。如用于基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，雜交的嚴(yán)格性較低、低溫、時(shí)間長(zhǎng)、鹽濃度高；若用于突變檢測(cè)，則雜交條件相反（5）。芯片分子雜交的特點(diǎn)是探針固化，樣品熒光標(biāo)記，一次可以對(duì)大量生物樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，雜交過程只要30min。美國(guó)Nangon公司采用控制電場(chǎng)的方式，使分子雜交速度縮到1min，甚至幾秒鐘（6）。德國(guó)癌癥研究院的Jorg Hoheisel等認(rèn)為以肽核酸（PNA）為探針效果更好。
2．4 雜交圖譜的檢測(cè)和分析
用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不雜交的無熒光。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析，得到有關(guān)基因圖譜。目前，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等更靈敏`、快速，有取代熒光法的趨勢(shì)。
3 應(yīng)用
3．1 測(cè)序
基因芯片利用固定探針與樣品進(jìn)行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜而排列出待測(cè)樣品的序列，這種測(cè)定方法快速而具有十分誘人的前景。Mark chee等用含135000個(gè)寡核苷酸探針的陣列測(cè)定了全長(zhǎng)為16.6kb的人線粒體基因組序列，準(zhǔn)確率達(dá)99%（7）。Hacia等用含有48000個(gè)寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3.4kb長(zhǎng)度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，提示了二者在進(jìn)化上的高度相似性（8）。
3．2 基因表達(dá)水平的檢測(cè)。
用基因芯片進(jìn)行的表達(dá)水平檢測(cè)可自動(dòng)、快速地檢測(cè)出成千上萬個(gè)基因的表達(dá)情況。Schena等采用擬南芥基因組內(nèi)共45個(gè)基因的cDNA微陣列（其中14個(gè)為完全序列，31個(gè)為EST），檢測(cè)該植物的根、葉組織內(nèi)這些基因的表達(dá)水平，用不同顏色的熒光素標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后分別與該微陣列雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微掃描，發(fā)現(xiàn)該植物根和葉組織中存在26個(gè)基因的表達(dá)差異，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達(dá)高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫構(gòu)建一個(gè)代表1046個(gè)基因的cDNA微陣列，來檢測(cè)體外培養(yǎng)的T細(xì)胞對(duì)熱休克反應(yīng)后不同基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)基因在處理后存在非常明顯的高表達(dá)，11個(gè)基因中度表達(dá)增加和6個(gè)基因表達(dá)明顯抑制。該結(jié)果還用熒光素交換標(biāo)記對(duì)照和處理組及RNA印跡方法證實(shí)（10）。在HGP完成之后，用于檢測(cè)在不同生理、病理?xiàng)l件下的人類所有基因表達(dá)變化的基因組芯片為期不遠(yuǎn)了（11）。
3．3 基因診斷
從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如，Affymetrix公司，把P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，Heller等構(gòu)建了96個(gè)基因的cDNA微陣，用于檢測(cè)分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用（12）。現(xiàn)在，肝炎病毒檢測(cè)診斷芯片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進(jìn)入市場(chǎng)。基因診斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價(jià)值的應(yīng)用。
3．4 藥物篩選
如何分離和鑒定藥的有效成份是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開發(fā)遇到的重大障礙，基因芯片技術(shù)是解決這一障礙的有效手段，它能夠大規(guī)模地篩選、通用性強(qiáng)，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異。如果再用m RNA 構(gòu)建c DNA表達(dá)文庫,然后用得到的肽庫制作肽芯片,則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)?；蛘?利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，更有利與靶分子相結(jié)合，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白孵育，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此芯片技術(shù)和RNA庫的結(jié)合在藥物篩選中將得到廣泛應(yīng)用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學(xué)合成及DNA芯片技術(shù)篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結(jié)構(gòu)的抑制物，實(shí)驗(yàn)表明，這種篩選物對(duì)HIV感染細(xì)胞有明顯阻斷作用。（13）生物芯片技術(shù)使得藥物篩選，靶基因鑒別和新藥測(cè)試的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片藥物篩選技術(shù)工作目前剛剛起步，美國(guó)很多制藥公司已開始前期工作，即正在建立表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，從而為藥物篩選提供各種靶基因及分析手段。這一技術(shù)具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
3．5 給藥個(gè)性化
臨床上，同樣藥物的劑量對(duì)病人甲有效可能對(duì)病人乙不起作用，而對(duì)病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應(yīng)差異很大。這主要是由于病人遺傳學(xué)上存在差異，如藥物應(yīng)答基因，導(dǎo)致對(duì)藥物產(chǎn)生不同的反應(yīng)。例如細(xì)胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關(guān)，如果病人該酶的基因發(fā)生突變就會(huì)對(duì)降壓藥異喹胍產(chǎn)生明顯的副作用，大約5%~10%的高加索人缺乏該酶基因的活性?，F(xiàn)已弄清楚這類基因存在廣泛變異，這些變異除對(duì)藥物產(chǎn)生不同反應(yīng)外，還與易犯各種疾病如腫瘤、自身免疫病和帕金森病有關(guān)。如果利用基因芯片技術(shù)對(duì)患者先進(jìn)行診斷，再開處方，就可對(duì)病人實(shí)施個(gè)體優(yōu)化治療。另一方面，在治療中，很多同種疾病的具體病因是因人而異的，用藥也應(yīng)因人而異。例如乙肝有較多亞型，HBV基因的多個(gè)位點(diǎn)如S,P及C基因區(qū)易發(fā)生變異。若用乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片每隔一段時(shí)間就檢測(cè)一次，這對(duì)指導(dǎo)用藥防止乙肝病毒耐藥性很有意義。又如，現(xiàn)用于治療AIDS的藥物主要是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑，但在用藥3-12月后常出現(xiàn)耐藥，其原因是rt、pro基因產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。Rt基因四個(gè)常見突變位點(diǎn)是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四個(gè)位點(diǎn)均突變較單一位點(diǎn)突變后對(duì)藥物的耐受能力成百倍增加（14）。如將這些基因突變部位的全部序列構(gòu)建為DNA芯片，則可快速地檢測(cè)病人是這一個(gè)或那一個(gè)或多個(gè)基因發(fā)生突變，從而可對(duì)癥下藥，所以對(duì)指導(dǎo)治療和預(yù)后有很大的意義。
此外，基因芯片在新基因發(fā)現(xiàn)、藥物基因組圖、中藥物種鑒定、DNA計(jì)算機(jī)研究等方面都有巨大應(yīng)用價(jià)值。
4 基因芯片國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和前景
自從1996年美國(guó)Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)用的生物芯片，并制作出芯片系統(tǒng)（15），此后世界各國(guó)在芯片研究方面快速前進(jìn)，不斷有新的突破。美國(guó)的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國(guó)都積極開展DNA芯片研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國(guó)公司也相繼投以巨資開展芯片研究。98年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析協(xié)會(huì)（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一個(gè)統(tǒng)一的技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)更有效而價(jià)謙的設(shè)備，與此相呼應(yīng)，英國(guó)的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布將提供部分掌握的技術(shù)以推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用（16）。美國(guó)關(guān)于芯片技術(shù)召開了兩次會(huì)議，克林頓總統(tǒng)在會(huì)上高度贊賞和肯定該技術(shù)，將基因芯片看作是保證一生健康的指南針（17）。預(yù)計(jì)在今后五年內(nèi)生物芯片銷售可達(dá)200-300億美元；據(jù)《財(cái)富》雜志預(yù)測(cè)（97.3），在21世紀(jì)，生物芯片對(duì)人類的影響將可能超過微電子芯片。
我國(guó)在生物芯片研究方面剛剛起步，以97香山會(huì)議以來，我國(guó)對(duì)生物芯片高度重視，98年10月，中科院將基因芯片列為"九五"特別支持項(xiàng)目，利用中科院在微電子技術(shù)、生化技術(shù)、物理檢測(cè)技術(shù)方面的優(yōu)勢(shì)，組織跨所、跨學(xué)科合作。現(xiàn)在以中科院上海冶金所為龍頭，與上海原子核所、有機(jī)所、生化所、遺傳所、腫瘤所、病毒所、上海醫(yī)科大學(xué)、上海市疾病檢測(cè)中心、華東師大等單位組成強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片設(shè)計(jì)、基片修飾、探針固定、樣品標(biāo)記、雜交和檢測(cè)等方面的技術(shù)都有較大的進(jìn)展，已研制出肝癌基因差異表達(dá)芯片、乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實(shí)用意義的基因芯片和DNA芯片檢測(cè)儀樣機(jī)。中科院上海冶金所等又將在徐元森院士、趙建龍博士等帶領(lǐng)下，決心開發(fā)重大傳染性疾病的診斷芯片及檢測(cè)設(shè)備，如HBV、HCV、TB三種基因診斷芯片。上海細(xì)胞所正在進(jìn)行人類全套基因組的cDNA陣列和微陣列制備，為我國(guó)科研和開發(fā)提供一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，并使之產(chǎn)業(yè)化。同時(shí)，清華、復(fù)旦、東南大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、華東理工大學(xué)、第一軍醫(yī)大學(xué)等單位都在積極進(jìn)行芯片研究。2000年國(guó)際生物芯片技術(shù)大會(huì)于10月11-14在北京召開，這又是對(duì)我國(guó)生物芯片技術(shù)有很大的促進(jìn)作用。
總之，我國(guó)基因芯片研究也緊跟國(guó)際前沿，力爭(zhēng)在此高新技術(shù)領(lǐng)域里有一席之地，它將對(duì)我國(guó)生命科學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，新藥篩選具有革命性的推動(dòng)作用，也將對(duì)我國(guó)人口素質(zhì)、農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)等作出具大的貢獻(xiàn)，同時(shí)帶動(dòng)我國(guó)科學(xué)整體進(jìn)步，為各相關(guān)高科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造機(jī)會(huì)?；蛐酒瑢⒊蔀?1世紀(jì)最令人注目的高新技術(shù)領(lǐng)域之一，將使人類早日進(jìn)入生物信息時(shí)代。
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