最近看到很多戰(zhàn)友在論壇上詢問如何查詢基因序列、如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、如何使用BLAST進(jìn)行序列比對……，這些問題在NCBI上都可以方便的找到答案?，F(xiàn)在我就結(jié)合我自己使用NCBI的一些經(jīng)歷（經(jīng)驗(yàn)）跟大家交流一下BCBI的使用。希望大家都能發(fā)表自己的使用心得，讓我們共同進(jìn)步！
我分以下幾個部分說一下NCBI的使用：
Part one： 如何查找基因序列、mRNA、Promoter （第一頁）
Part two ：如何查找連續(xù)的mRNA、cDNA、蛋白序列（第一頁）
Part three ：運(yùn)用STS查找已經(jīng)公布的引物序列（第二頁）
Part four： 如何運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗(yàn)引物特異性（第三頁）
Part Five：5.1 從SNP的序列號入手找到其對應(yīng)的基因序列和該SNP在基因組中的具體位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位點(diǎn)（第四頁） 如果您感覺網(wǎng)頁形式看起來太亂，請到 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9681760&sty=1&tpg=2&age=0 下載PDF版本（此PDF版本為我實(shí)驗(yàn)室的lzfist所整理，包含前四部分內(nèi)容）特別感謝本版版主，將這個帖子置頂！
從發(fā)帖到現(xiàn)在，很多戰(zhàn)友對該帖給與了積極的關(guān)注，在此向給我投票的（以及想給我投票卻暫時(shí)不能投票的）各位戰(zhàn)友表示真誠的感謝，謝謝各位戰(zhàn)友！
請大家對以下我發(fā)表的內(nèi)容提出自己的意見。關(guān)于NCBI其他方面的使用也請水平較高的戰(zhàn)友給予補(bǔ)充。First of all，還是讓我們從查找基因序列開始。
Part one: 利用Map viewer查找基因序列、mRNA序列、啟動子（Promoter）[同一個頁面即可顯示基因序列和啟動子]
下面以人的IL6（白細(xì)胞介素6）為例講述一下具體的操作步驟
一、打開Map viewer頁面，網(wǎng)址為：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html
在search的下拉菜單里選擇物種，for后面填寫你的目的基因。操作完畢如圖所示：
二、點(diǎn)擊“GO”出現(xiàn)如下頁面： 三、在步驟二圖示的右下角有一個Quick Filter,下面是讓你選擇的幾個復(fù)選框，在Gene前面的小方框里打勾，然后點(diǎn)擊Filter. 出現(xiàn)下圖：
說明一下：1、染色體的紅色區(qū)域即為你的目的基因所處位置。2、下面參考序列給出了三個，是不同的部門做出來的，經(jīng)我驗(yàn)證，序列有微小的差異，但總體來說基本相同。盡管你分別點(diǎn)擊后，序列代碼、序列代碼等有所差異，但堿基基本一致，不影響大家研究分析序列?，F(xiàn)在普遍采用的是最上面的那個序列，這一條是世界范圍的生物科學(xué)家用計(jì)算機(jī)合成的一個序列。我也推薦大家使用這個序列。
四、點(diǎn)擊上述三條序列第一條序列（即reference）對應(yīng)的"Genes seq"，出現(xiàn)新的頁面，頁面下方為：
五、點(diǎn)擊上圖出現(xiàn)的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下載查看序列等功能，結(jié)果如圖所示：
先對上面這張圖做點(diǎn)簡要的說明，在Sequence Format（序列輸出格式）后面是一個下拉式選擇菜單，默認(rèn)的為FASTA格式，還有一個是GenBank格式。我推薦大家選擇GenBnak格式，因?yàn)檫@個格式提供了很多該基因的信息，而FASTA格式只有基因序列。六、在Sequence Format后選擇GenBank，然后點(diǎn)擊下面的Display，目的基因的相關(guān)信息和序列就出現(xiàn)在眼前了。點(diǎn)擊后如圖所示（網(wǎng)頁較大，只抓取一小部分以作示范）：
在上述打開的網(wǎng)頁中，你可以看到基因長度，基因序列，以及這個基因是如何被報(bào)道出來的等各種信息。
你會看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 這代表了從基因的3598位開始就是轉(zhuǎn)錄區(qū)了，即我們常說的mRNA片斷，由于內(nèi)含子的存在，所以mRNA在DNA序列上分成了幾段。
CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970)
CDS代表編碼序列，即蛋白編碼區(qū)是從3660開始的（ATG），由于剪接作用所以CDS區(qū)也是不連續(xù)的。
說到這里，可能很多朋友都已經(jīng)明白了promoter即啟動子區(qū)域在哪里了。但我還是再嘮叨幾句：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前面是基因的調(diào)控區(qū)，啟動子區(qū)沒有明顯的位置定義，大家也只是猜測它的大體位置，如果你要研究promoter區(qū)的話，建議你選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的2000個堿基進(jìn)行研究，一般默認(rèn)的是這樣。當(dāng)然你如果覺得長度太長不好研究的話，也可以只研究-1000到0這一千個堿基，因?yàn)橐话闱闆r下，啟動子區(qū)的變異都在這個區(qū)域內(nèi)。
這樣大家就可以找到自己的目的基因序列和啟動子了，這種方法可能使用的人不是很多，但我個人比較喜歡，因?yàn)樗畲蟮膬?yōu)點(diǎn)是可以找到啟動子區(qū)域和其他調(diào)控區(qū)域。希望大家可以發(fā)帖交流，讓我們把NCBI用的更好！
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Part two 如何查找連續(xù)的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人類的IL6為例）
1、進(jìn)入NCBI主頁：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
在search后面選擇Gene，在for后面填寫需要查找的基因的名字。如圖所示：
點(diǎn)擊“Go”，出現(xiàn)以下界面：
出現(xiàn)了很多基因序列，在每個序列的右邊還有“Order cDNA clone” 的鏈接，這些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是別名（Other Aliases）與你的目的基因一致，根據(jù)每個序列的介紹認(rèn)真選擇你的目的基因。上圖中我需要的IL6是標(biāo)號為2的序列。
2.1、查找cDNA序列
2.1.1、點(diǎn)擊Order cDNA clone, 出現(xiàn)目的頁面如圖所示：
2.1.2、點(diǎn)擊Clone Sequence后面的鏈接即可得到cDNA序列。點(diǎn)擊后如圖所示（只抓取其中一部分）：
2.2、查找mRNA、蛋白序列
回到步驟1點(diǎn)擊“Go”之后出現(xiàn)的頁面，點(diǎn)擊目的基因的名字，出現(xiàn)以下頁面(只抓取相關(guān)部分)：
頁面的下半部分，即可以獲取mRNA和蛋白序列的部分：
找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分為幾個板塊，第一個“mRNA and Protein
”區(qū)可以讓我們找到連續(xù)的編碼mRNA序列和蛋白序列。在mRNA and Protein
下面有兩個序列代碼（中間劃有一個箭頭），這代表了mRNA序列和蛋白序列。分別點(diǎn)擊就可以得到相應(yīng)的序列頁面。點(diǎn)擊后如圖所示，mRNA序列：
NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二個板塊是Reference assembly，它下面顯示的是Genomic ，點(diǎn)擊Genomic下面Reference assembly對應(yīng)的Genbank或FASTA即可出現(xiàn)編碼的DNA序列（注意：只是編碼序列，其中包括內(nèi)含子，但一般沒有5‘非編碼區(qū)）。這一步就不做貼圖演示了吧，呵呵。
這樣我們就可以找到基因的cDNA序列、連續(xù)的編碼mRNA序列、蛋白序列以及含有內(nèi)含子的編碼DNA序列了。相信這些操作對很多戰(zhàn)友還是有用的。
如果大家有更好的方法，歡迎發(fā)帖交流！
友情提示：在NCBI里打開的每一個頁面都會給我們提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能會有令我們驚喜的收獲！
最后嘮叨一句：最近我實(shí)驗(yàn)比較忙，只能在深夜發(fā)帖，可能要過幾天再發(fā)第三部分[Part three 運(yùn)用STS查找已經(jīng)公布的引物序列]，希望“期待下集”的朋友可以理解。
STS，序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA序列（200－500個堿基對），這種序列在染色體上只出現(xiàn)一次，其位置和堿基順序都是已知的。在PCR反應(yīng)中可以檢測處STS來，STS適宜于作為人類基因組的一種地標(biāo)，據(jù)此可以判定DNA的方向和特定序列的相對位置。
以上內(nèi)容基本是STS的定義，我主張活學(xué)活用，下面就介紹一下我個人用STS數(shù)據(jù)庫查找引物的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)。
一步一步教你使用NCBI之三：
Part three 運(yùn)用STS查找已經(jīng)公布的引物序列還是使用人的IL6基因?yàn)槔?，呵?br>
一、打開NCBI主頁，在Search后面的下拉菜單選擇UniSTS，在FOR后面填寫目的基因。
操作完畢如圖所示：
點(diǎn)擊GO以后出現(xiàn)以下頁面，
這是你會發(fā)現(xiàn)NCBI又提供了很多序列，下面我們還是要初步篩選我們需要的序列。
二、根據(jù)物種、目的陰物所在染色體的位置等選擇相應(yīng)序列（可能不只一個），點(diǎn)擊。
下面以點(diǎn)擊第一個進(jìn)入的畫面為例。
你會發(fā)現(xiàn)這個頁面直接就給出了引物序列，PCR之后的片段長度也是給了的（247bp）。下面還有很多相關(guān)的信息……
三、點(diǎn)擊GeneBank Accession 后面的代碼，進(jìn)入下一個頁面。
??！前后引物都呈現(xiàn)在眼前了，還有反應(yīng)體系和反應(yīng)條件！其中Primer A是前引物序列，Primer B則是后引物序列，并且給出了他們在DNA序列中的位置。有興趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的， 不過要注意，PCR是雙鏈擴(kuò)增，在序列中可以直接找到的是Primer A的原序列 和 Primer B的互補(bǔ)序列。
在步驟二里面我只點(diǎn)開了一個序列，繼續(xù)打開其他的可能還會有對自己有用的引物，不過這要你自己慢慢發(fā)掘了。
這種尋找引物的方法有點(diǎn)投機(jī)取巧的味道，實(shí)用程度不是很高，但如果這里面恰好有你想P的片段的話，恭喜你，這些引物都是很成熟的引物，可以直接拿過來使用了。
如果想尋找引物，大家可以查閱相關(guān)論文，已經(jīng)報(bào)道的引物我們?yōu)槭裁床挥媚兀?！既省時(shí)間，可靠性又強(qiáng)。
如果這兩種方法都不能找到你需要的引物的話，那就自己設(shè)計(jì)吧，建議使用Primer 5 和 Oligo。引物設(shè)計(jì)的詳細(xì)內(nèi)容我在這里就不多說了，推薦兩個帖子給大家看一下，第一個是本版版主liuzeyi2002發(fā)起的，內(nèi)容很豐富，很值得學(xué)習(xí)，另一個則是我發(fā)的。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0Part four 如何運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗(yàn)引物特異性 將于下周與大家見面……夜色很深了，我也該睡覺了，祝大家實(shí)驗(yàn)順利，每天都能做個好夢！
Part four 如何運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗(yàn)引物特異性
提到序列比對，絕大多數(shù)戰(zhàn)友都會想到BLAST，但BLAST的使用確實(shí)又是一個很大的難題，因?yàn)樗墓δ鼙容^強(qiáng)悍，里面涉及到的知識比較多，而且比對結(jié)束后輸出的結(jié)果參數(shù)（指標(biāo)）又很多。如果把BLAST的使用詳細(xì)的都講出來，我想我發(fā)帖發(fā)到明天也發(fā)不完，更何況我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在這里也就“畫龍點(diǎn)睛”——以比對核酸序列為例來給大家介紹一下BLAST的使用，也算是BLAST的入門課程吧。
請看帖的戰(zhàn)友好好體會，如果你用心看，在看帖完畢之后BLAST的基本使用（包括其他序列的比對）應(yīng)該沒有問題了。 一、打開BLAST頁面，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 打開后如圖所示：
對上面這個頁面進(jìn)行一下必要的介紹：
BLAST的這個頁面主體部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂這三個短語的意思，我就不多說了；我要說的是，可以認(rèn)為這是三種序列比對的方法，或者說是BLAST的三條途徑。
第一部分BLAST Assembled Genomes就是讓你選擇你要比對的物種，點(diǎn)擊相應(yīng)物種之后即可進(jìn)入比對頁面。
第二部分Basic BLAST包含了5個常用的BLAST，每一個都附有簡短的介紹。
第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，這個時(shí)候你就需要在Specialized BLAST部分做出適當(dāng)?shù)倪x擇了。
總之，這是一個導(dǎo)航頁面，它的目的是讓你根據(jù)自己的比對目的選擇相應(yīng)的BLAST途徑。
下面以最基本的核酸序列比對來談一下BLAST的使用，期間我也會含沙射影的說一下其他序列比對的方法。
二、點(diǎn)擊Basic BLAST部分的nucleotide blast鏈接到一個新的頁面。打開后如圖所示：
介紹一下上述頁面：
Enter Query Sequence部分是讓我們輸入序列的，你可以直接把序列粘貼進(jìn)去，也可以上傳序列，還可以選擇你要比對的序列的范圍（留空就代表要比對你要輸入的整個序列）。Job Title部分還可以為本次工作命一個名字。
Choose Search Set部分是讓我們選擇要與目的序列比對的物種或序列種類（genome DNA、mRNA等等）。如果是人或老鼠的話，就可以直接選擇了如果是其他物種就要選擇“others”了，這時(shí)候網(wǎng)頁會主動跳出一個下拉對話框和一個輸入式對話框，你可以分別選擇和輸入要跟你的序列比對的序列種類和物種。下面的Entrez Query可以對比對結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)南拗啤?br>
Program Selection部分其實(shí)是讓我們選擇本次比對的精確度，種內(nèi)種間等等。
在BLAST按鈕下面有一個“Algorithm parameters” ，這是參數(shù)設(shè)置選項(xiàng)，一般用戶使用不到此項(xiàng)，所以它比較隱蔽，點(diǎn)擊，原網(wǎng)頁下方即可增加了Algorithm parameters的內(nèi)容。大部分戰(zhàn)友都用不到更改這里面的選項(xiàng)，我也不多說了，有興趣的朋友可以自己研究一下。
三、依次填寫上述網(wǎng)頁必須部分，點(diǎn)擊BLAST按鈕后，出現(xiàn)如下界面（只截取其中一部分）：
出現(xiàn)的這個結(jié)果頁面信息含量非常大，如果我們用心觀察，還是可以發(fā)現(xiàn)其中的一些主要指標(biāo)的。列舉上圖也是為了給大家展示一下這些評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。其中Description部分推薦大家詳細(xì)看一下，另外說一下“E value” 這個指標(biāo)與其他指標(biāo)不同，它的數(shù)值越小相似程度越高，其他幾個（如Totle score）都是數(shù)值越高相似度越高。
在這個圖示的表格下方就是具體的相似性的核酸序列了，還配合著各種參數(shù)的得分。
好了，各位親愛的戰(zhàn)友，我的BLAST就發(fā)到這里為止了，更具體的東西有待大家一起去努力研究。伴隨著BLAST的終結(jié)，我的“一步一步教你使用NCBI”也要暫時(shí)告一段落了，很高興自己發(fā)第一個帖子時(shí)說的話今天終于做到了。以后如果我有新的NCBI使用方法的話，我還會添加到這里來，但我想這一陣子是不會接著發(fā)了，呵呵。
真心希望各位戰(zhàn)友在這里一起交流自己使用NCBI的一些技巧，正如丁香園的宗旨一樣——“我為人人，人人為我”，讓我們互相學(xué)習(xí)、共同進(jìn)步，最后再一次祝愿大家試驗(yàn)順利！
yh9913 wrote:
樓主,我現(xiàn)在正在研究RNAi.通過對你1-3集的學(xué)習(xí),我順利的找到了我要的mRNA序列,也設(shè)計(jì)了siRNA序列,然后就一直苦等你的第四集BLAST.但我從昨天你發(fā)貼開始看,到現(xiàn)在也還沒學(xué)會怎么比對序列的同原性.樓主沒有舉例啊,所以看得很抽象.有問題請教:
urbest 說:
Enter Query Sequence部分是讓我們輸入序列的，你可以直接把序列粘貼進(jìn)去，也可以上傳序列，還可以選擇你要比對的序列的范圍（留空就代表要比對你要輸入的整個序列）。Job Title部分還可以為本次工作命一個名字。
請問,我要輸入的是整個mRNA序列,還是設(shè)計(jì)的siRNA序列?如果是輸入siRNA序列,是正義還是反義鏈的序列?方向是5'-3'還是3'-5'?那Query subrange 的"FROM ...TO ..."里該填什么內(nèi)容呢?
我用AMBION的設(shè)計(jì)軟件,出來很多siRNA序列,在用BLAST比對同源性時(shí),是不是只能一個序列一個序列的去檢測啊?那工作量就超大了啊!!!
本人很是愚鈍,急盼樓主和各位高手指點(diǎn)迷津!!謝謝了.....
對于以上yh9913戰(zhàn)友的提問，盡我所能回復(fù)如下：
1、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我個人認(rèn)為你應(yīng)該比對的是你設(shè)計(jì)的siRNA序列（現(xiàn)在再比對原mRNA好像沒有什么價(jià)值了吧）。
2、輸入跟要降解的RNA配對的那條鏈簡單直接一點(diǎn)，可以直接選擇只BLAST RNA。（其實(shí)，如果你有耐心，輸入siRNA的正義還是反義鏈都是一樣的，NCBI都會列舉出有可能跟他配對的所有序列，不管正義還是反義鏈，你的理想結(jié)果不都是跟某一特定的RNA結(jié)合效能較高嗎？你輸入兩條鏈的任何一條，NCBI都會列出與其配對的RNA、DNA and so on，你可以找到與你輸入序列配對的DNA看一下，主要看結(jié)合位置，需要耐心噢）。但要注意輸入的順序一定要是5‘到3‘。
3、我沒有做過RNAi，所以對AMBION也沒有了解。但我個人認(rèn)為他設(shè)計(jì)出來的這些siRNA序列應(yīng)該也有自己的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)吧，建議先選舉AMBION認(rèn)為較好的序列再使用BLAST比對。
4、關(guān)于BLAST是否可以多個序列同時(shí)比對的問題我也不是很清楚，我聽說可以，但至今我也不知道怎么才能做到。希望知情的戰(zhàn)友回帖指導(dǎo)。
Bonnie03 wrote:
請問urbest樓主，直到一個基因的rs號，如何確定它在整個基因組中的genome location?
以下內(nèi)容作為這一系列帖子的第五部分：
Part Five: 5.1 從SNP的序列號入手找到其對應(yīng)的基因序列和該SNP在基因組中的具體位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位點(diǎn)5.1 從SNP的序列號入手找到其對應(yīng)的基因序列和該SNP在基因組中的具體位置。
跟Bonnie03 PM之后，得到rs號為rs6677188，其實(shí)這不是一個基因的編號，而是一個SNP的編號。要得到它的詳細(xì)信息可以參考以下途徑，有興趣的戰(zhàn)友可以自己照著做一下，為了節(jié)約版面，不做詳細(xì)抓圖：
1，打開NCBI的SNP頁面，網(wǎng)址為
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Snp 在搜索的for后面填寫rs編號，點(diǎn)擊go
2，這時(shí)會出現(xiàn)搜索結(jié)果頁面，如圖所示：
由于編號是唯一的，所以搜索結(jié)果也是唯一的，如果要得到它的詳細(xì)信息，點(diǎn)擊該編號對應(yīng)的超鏈接即可。
3，點(diǎn)擊該編號對應(yīng)的超鏈接，得到詳細(xì)信息頁面，如圖所示（抓取部分頁面）：
4.1 如果要得到該SNP所在基因的序列，可通過點(diǎn)擊NCBI Resource Links對應(yīng)的序列代碼實(shí)現(xiàn)，建議選擇GenBank(即NT 032977)，這里不做演示，有興趣的朋友可以自己操作。
4.2 如果要得到該SNP在基因組里的位置圖，可以通過點(diǎn)擊Integrated Maps對應(yīng)的超鏈接（即chromosome1）來實(shí)現(xiàn)，點(diǎn)擊后出現(xiàn)下圖：
如果你看過這個帖子前幾部分的內(nèi)容，對這張圖一定不陌生了，呵呵
5，要得到這個SNP在基因組中詳細(xì)的位置，點(diǎn)擊Map element下面對應(yīng)的超鏈接就可以了，這里就不抓圖演示了，建議選擇第一個，即reference所對應(yīng)的。
以上內(nèi)容都是建立在查找文獻(xiàn)后，知道了一個既定的位點(diǎn)后而進(jìn)行的。
5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位點(diǎn)
如果要查找一個基因所有已公布的SNP信息，可以直接打開SNP主頁，在搜索框里填寫目的基因名字，然后搜索，下面的問題就不復(fù)雜了，相信大家可以自己實(shí)現(xiàn)，我就不多說了。
關(guān)于SNP暫時(shí)先說這么多，關(guān)于何如使用NCBI查找SNP方面的信息，歡迎大家發(fā)帖交流，我自己也是做SNP方面的試驗(yàn)，也希望這面的知識能夠知道更多，期待大家指導(dǎo)……
