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miRNA是研究最早的非編碼RNA研究，隨著lncRNA和circRNA的興起，miRNA研究已失去前沿?zé)狳c(diǎn)的地位。另一方面，由于miRNA研究論文眾多，簡(jiǎn)單的miRNA-靶分子-通路套路基本維持在2分左右的水平。例如以下兩篇近期發(fā)表在《Oncology letter》上的論文。

應(yīng)該如何提升miRNA研究的水平呢？今天米粒兒跟大家分享一篇近期發(fā)表在 《Cancer letter》上的論文（IF=6.375），或許你能得到啟示。

題目：EGFR/c-myc axis regulates TGFβ silencing miR-524 in gliomas

從題目上看，本文有著比較復(fù)雜的機(jī)制研究，涉及EGFR/c-myc信號(hào)軸和TGFβ通路。在選擇miR-524為主要研究對(duì)象后，作者首先找到其上游分子EGFR并且指出EGFR通過(guò)組蛋白修飾作用調(diào)節(jié)miR-524。之后驗(yàn)證了miR-524靶分子Smad2，Tead1和Hes1，順著靶分子找到了下游明星通路TGFβ，Notch和Hippo。

一般的研究到這里就結(jié)束了，但是這篇論文在此基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)明星通路下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc又可以調(diào)節(jié)上游EGFR的表達(dá)，從而形成了一個(gè)閉合回路，使研究檔次進(jìn)一步提升。所以縱觀全文，既包含上游分子，靶分子，下游通路，又找到閉合回路，從機(jī)制上講研究極為深入。這是本文第一個(gè)亮點(diǎn)。

本文的第二個(gè)亮點(diǎn)在于，研究主要對(duì)象為兩個(gè)miRNA，分別為miRNA-524-3p和miRNA-524-5p，并且證實(shí)二者具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

我們下邊具體批講一下本文主要內(nèi)容：

作者在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇130例樣品。將GBM分為原神經(jīng)，神經(jīng)中樞，經(jīng)典，間葉細(xì)胞亞型分別進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典的GBM亞型中，EGFR表達(dá)量最高，并且EGFR vIII的突變比例也最高。

為了鑒別經(jīng)典的GBM亞型和其他亞型中miRNA表達(dá)區(qū)別，作者分析了CGGA中64個(gè)GBM樣品中miRNA芯片表達(dá)譜，在下圖B中列出了100個(gè)表達(dá)量改變最顯著的miRNA。

其中miR-524-5p和 miR-524-3p在經(jīng)典GBM亞型中表達(dá)量明顯降低。并且EGFR的mRNA表達(dá)量和miR-524-5p， miR-524-3p表達(dá)量明顯負(fù)相關(guān)（圖E和F）。

生存分析結(jié)果提示miR-524-5p， miR-524-3p和患者預(yù)后相關(guān)（圖G和H）。同時(shí)，它們也和患者的病理分級(jí)顯著相關(guān)（圖I和J）。

在U87和LN229細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-524-5p和miR-524-3p后，分別檢測(cè)細(xì)胞侵襲和細(xì)胞增殖能力的變化。發(fā)現(xiàn)miR-524-5p和miR-524-3p可降低膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并抑制細(xì)胞增殖。

為了評(píng)價(jià)2個(gè)miRNA共同作用效率，作者分別建立了3個(gè)不同的表達(dá)體系：

（1）miR-524-5p 0nM + miR-524-3p 30nM，（2）miR-524-5p 30nM + miR-524-3p 0nM，（3）miR-524-5p 15nM + miR-524-3p 15 nM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體系3中細(xì)胞侵襲能力和增殖能力都比體系1和2更低，相似的，細(xì)胞周期分析結(jié)果也顯示體系3中阻滯在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量更多。

為了驗(yàn)證EGFR / EGFR vIII是否影響Pri-miR-524表達(dá)，分別采用EGF刺激，EGFR vIII病毒，EGFR抑制劑（MK2206）處理U87細(xì)胞。并采用RT-PCR和western blot檢測(cè)Pri-miR-524表達(dá)，結(jié)果顯示EGF和EGFR vIII處理后Pri-miR-524表達(dá)升高，而MK2206處理后Pri-miR-524表達(dá)降低。并且EGF和EGFR vIII處理后，AKT和STAT3磷酸化水平升高，EZH2表達(dá)升高。

接下來(lái)，作者探討EGFR/EGFRvIII 如何降低miR-524表達(dá)量呢？眾所周知，EZH2可導(dǎo)致H3K27的三甲基化，并且H3K4me3 和 H3K27me3二價(jià)區(qū)域可平衡發(fā)育基因的表達(dá)。因此為了檢測(cè)Pri-miR-524啟動(dòng)子區(qū)的二價(jià)區(qū)主要功能，采用ChIP聯(lián)合RT-qPCR方法，檢測(cè)CpG島的特異性結(jié)合。

結(jié)果顯示H3K4me3和H3K27me3富集在Pri-miR-524啟動(dòng)子區(qū)。而過(guò)表達(dá)EGFR/EGFR vIII 降低Pri-miR-524啟動(dòng)子區(qū)H3k4me3的富集量，提高H3K27me3的富集量。而當(dāng)采用MK2206處理后，趨勢(shì)相反。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGFR/EGFRvIII可通過(guò)與二價(jià)區(qū)域反應(yīng)沉默Pri-miR-524。

在確定了上游調(diào)節(jié)分子后，作者下一步策略為尋找miR-524的靶分子。作者首先對(duì)CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚集分析，接著采用不同miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)初步確定miR-524可能作用的mRNA為Hes1，Smad2和Tead1。通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-524-3p表達(dá)與Smad2和Hes1 mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)，miR-524-5p與Tead1和Hes1表達(dá)負(fù)相關(guān)。

采用Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)證實(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果。并且在miR-524-3p/miR-524-5p轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中敲除Smad2/Tead1/Hes1后，檢測(cè)細(xì)胞侵襲，轉(zhuǎn)移和增殖能力減弱。

已經(jīng)有了靶基因，那么它的下游通路是什么呢？作者對(duì)Smad2，Tead1和Hes1在四類分子亞型中進(jìn)行聚集分析，發(fā)現(xiàn)Smad2，Tead1和Hes1在經(jīng)典亞型中表達(dá)顯著升高。采用Western blot分析TGFβ，Notch和Hippo通路相關(guān)marker表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)miR-524表達(dá)升高時(shí)，這些通路共同沉默C-myc。

在上面的實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)miR-524抑制c-myc表達(dá)，為了深入研究該作用機(jī)制，構(gòu)建了CRISPR-miR-524-on體系。首先miR-524調(diào)節(jié)EGFR vIII抑制的c-myc表達(dá)。Western blot和q-PCR結(jié)果證實(shí)EGFR vIII處理后，c-myc表達(dá)降低。

而采用CRISPR-on體系過(guò)表達(dá)miR-524后，c-myc抑制效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。最后，我們發(fā)現(xiàn)不僅c-myc被抑制，EGFR/EGFR vIII 的表達(dá)也被降低。

那么miR-524是如何降低EGFR/EGFR vIII 的表達(dá)呢？這是因?yàn)閏-myc可作為EGFR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。如下圖7G所示，作者證實(shí)c-myc可結(jié)合在EGFR/EGFR vIII 的轉(zhuǎn)錄啟示位點(diǎn)。并且采用ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)c-myc直接調(diào)節(jié)EGFR/EGFR vIII 的表達(dá)。

最后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中作者也證實(shí)miR-524可抑制腫瘤形成，并影響Smad2，Hes1和Tead1的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：EGFR/c-myc axis regulates TGFβ silencing miR-524 in gliomas