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作者：小又
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如果要評2017年RNA領(lǐng)域最火熱的研究，m6A修飾一定榜上有名！這不，2017年還未過完，RNA m6A的研究就已多次登上nature, cell, cancer cell等許多著名雜志，涉及領(lǐng)域從RNA翻譯效率到DNA損傷修復(fù)，從生長發(fā)育到腫瘤形成，m6A的影響力可見一斑。
然而，m6A的研究才剛剛開始，還有很多空白，還有很多值得探索的問題。小伙伴們是不是摩拳擦掌，躍躍欲試卻又不知關(guān)于RNA m6A的研究該從哪下手呢？不用擔(dān)心，跟著小又，只需三步，帶你玩轉(zhuǎn)RNA m6A修飾研究！
一圖看懂RNA修飾
磨刀不誤砍柴工，步入正題前，一幅圖讓大家了解什么是RNA m6A修飾。
如上圖，m6A是mRNA上最豐富的甲基化修飾，指堿基A第6位N原子上的甲基，主要存在于mRNA的CDS區(qū)和3‘UTR區(qū)，影響mRNA的穩(wěn)定性，翻譯效率，可變剪接和定位等。此外，長非編碼RNA以及microRNA等非編碼RNA也存在m6A位點(diǎn)。
RNA甲基化分子機(jī)制
RNA甲基化過程需要三類分子參與：Writers, Erasers和Readers。
Writers：在RNA加上甲基，介導(dǎo)RNA的甲基化修飾過程。干這活的是甲基轉(zhuǎn)移酶，最常見的分子是METTL3和METTL14，兩者可在體外和體內(nèi)催化mRNA（和其他細(xì)胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是這種甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的另一個(gè)關(guān)鍵組分。
Erasers：將RNA上甲基去除，介導(dǎo)RNA的去甲基化修飾過程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他細(xì)胞核RNA）上的m6A甲基化。
Readers：識別RNA甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過程。比如，YTHDC1可與mRNA上的m6A修飾，促進(jìn)mRNA出核運(yùn)輸與可變剪接。YTHDF1/YTHDF3識別m6A后可促進(jìn)mRNA的翻譯，而YTHDF2與m6A的結(jié)合則會促進(jìn)mRNA的降解。
RNA甲基化研究實(shí)例
接下來，以一篇今年初發(fā)表在cancer cell上的文章為例，帶大家解析m6A研究的三步套路。
由上文的m6A簡介可以看出，m6A由相應(yīng)的蛋白酶完成，那么，要研究m6A在某一體系中的作用，也要從m6A相關(guān)蛋白酶下手。研究者通過整理之前的RNA芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FTO(m6A去甲基化酶)在特定的急性髓系白血病中高表達(dá)，并且通過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，在含MLL-AF9融合蛋白的白血病中，m6A的整體水平比對照組低。
那么，F(xiàn)TO在特定白血病亞型中的高表達(dá)，是否是其發(fā)揮了癌基因的功能呢？通過構(gòu)建穩(wěn)定敲低FTO的細(xì)胞系，研究者在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)中證明，敲低FTO可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及延長實(shí)驗(yàn)小鼠的生存時(shí)間。
接下來，就是文章的重點(diǎn)和難點(diǎn)——FTO發(fā)揮癌基因作用的具體機(jī)制是什么？關(guān)于機(jī)制的探索，這不僅是m6A研究的重點(diǎn)，相信也是每個(gè)課題都要面對的問題。幸運(yùn)的是，F(xiàn)TO做為m6A的去甲基化酶，功能是相對確定的，要尋找FTO的具體作用機(jī)制，實(shí)際上是尋找FTO靶向的mRNA。
這里不得不提到的是m6A-seq技術(shù)，該技術(shù)通過用m6A特異的抗體將含m6A修飾的mRNA從總mRNA中富集出來，再結(jié)合高通量測序技術(shù)，就可以知道哪些mRNA含有m6A修飾。
研究者通過對過表達(dá)FTO和正常樣品的m6A-seq測序，發(fā)現(xiàn)了一批在過表達(dá)FTO后m6A修飾減少的基因，然后結(jié)合普通RNA測序，發(fā)現(xiàn)這些m6A減少的mRNA在表達(dá)量上也發(fā)生了變化。
研究者從變化倍數(shù)以及基因本身的功能著手，最終鎖定了兩個(gè)基因：ASB2和RARA并認(rèn)為它們是FTO最主要的靶標(biāo)，并在western blot實(shí)驗(yàn)以及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。End。
文章解析到這，相信大家也已經(jīng)看出了m6A研究的三步套路：
1.尋找m6A相關(guān)酶在某一體系（疾?。┲械漠惓１磉_(dá)情況。鑒于mRNA的測序和芯片數(shù)據(jù)較全，建議大家從數(shù)據(jù)庫中尋找，比如cbioportal,oncomime和GEO datasets等。
2.細(xì)胞及動物的表型實(shí)驗(yàn)。通過敲低和過表達(dá)該m6A修飾酶，檢測細(xì)胞的變化，包括細(xì)胞增殖，凋亡，衰老等指標(biāo)。
3.通過m6A-seq和RNA-seq的結(jié)合，尋找m6A含量變化和RNA分子數(shù)量變化最大的mRNA。這部分工作對生物信息學(xué)的要求較高，好在已有部分測序公司可以提供相關(guān)的分析。
以上，大家是否感覺cancer cell的文章也不是很難呢？這篇文章的亮點(diǎn)在于第一次在腫瘤中系統(tǒng)地研究了m6A去甲基化酶FTO的功能，并建立了較完善的研究方法，對后人的研究啟發(fā)很大，也是一篇里程碑式的文章！
Q&A
現(xiàn)在，腫瘤中m6A的功能研究還有很多空白之處，小伙伴們看準(zhǔn)了就趕緊下手吧！想到大家在研究中可能遇到的問題，小又在此先自問自答了。
1 我研究的領(lǐng)域是XX癌，但是翻遍了各大數(shù)據(jù)庫，都沒發(fā)現(xiàn)METTL3/FTO和ALKBH5等m6A相關(guān)酶有差異表達(dá)，怎么辦？m6A是不是跟我無緣了？
回答：要想和這樣一個(gè)重要的RNA修飾擦肩而過，還真是挺難的。M6A甲基化酶在某一體系中即使沒有異常表達(dá)，也不能說它們沒有功能。
推薦這篇PNAS的文章，研究者通過閱讀m6A文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)NANOG的mRNA有m6A修飾，而NANOG在乳腺癌中是一個(gè)非常重要的癌基因，猜測m6A是否會在NANOG介導(dǎo)的乳腺癌中發(fā)揮功能，并在通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)。
2 除了m6A-seq外是不是還有其他RNA甲基化的檢測方法？
回答：對RNA甲基化的研究才剛起步，因此現(xiàn)在RNA甲基化的檢測方法并不多，大致有3種，除了m6A-seq之外還有miCLIP和SCARLET。
miCLIP是將含有m6A的RNA與相應(yīng)抗體結(jié)合以后，通過紫外進(jìn)行交聯(lián)，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA會出現(xiàn)突變或者截?cái)?，這樣就可以指示m6A的存在。該方法的分辨率為單核苷酸水平。
SCARLET則是通過結(jié)合位點(diǎn)特異性的RNA酶H、放射標(biāo)記和TLC（薄層層析）的方法，對RNA甲基化修飾進(jìn)行檢測，該方法是從單基因通量下檢測RNA的甲基化修飾。3 套路太簡單了，想要做得更深，更有新意，該怎么辦？
回答：欣賞你這樣的有志少年！推薦也是今年發(fā)表在cancer cell上的文章，研究者發(fā)現(xiàn)m6A去甲基化酶ALKBH5通過影響FOXM1的功能，在惡性膠質(zhì)瘤中扮演癌基因的角色，并創(chuàng)造性的將近年來火熱的長非編碼RNA納入該研究，發(fā)現(xiàn)ALKBH5對FOXM1的選擇性去甲基作用是通過長非編碼RNA FOXM1-AS介導(dǎo)的。
