幾十年前，從在免疫球蛋白表征重組和人單克隆IgG抗體發(fā)現(xiàn)二硫鍵結(jié)構(gòu)，二硫鍵就一直受到關(guān)注。首先在IgG4中鑒定非經(jīng)典的二硫鍵結(jié)構(gòu)，然后在IgG2抗體中鑒定。盡管半胱氨酸殘基應(yīng)處于二硫鍵鍵合狀態(tài)，但已在IgG抗體的所有亞類中檢測到游離巰基。此外，二硫鍵易受化學(xué)修飾的影響，其可進(jìn)一步產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變體，例如具有三硫鍵（trisulfide）或硫醚鍵（thioether）的IgG抗體。還觀察到所有亞類的IgG形成三硫鍵。通過β-消除降解二硫鍵產(chǎn)生游離巰基二硫化物和脫氫丙氨酸。游離巰基和脫氫丙氨酸之間的進(jìn)一步反應(yīng)導(dǎo)致形成不可還原的交聯(lián)物質(zhì)。脫氫丙氨酸殘基的水解基本上有助于抗體鉸鏈區(qū)（hinge region）片段化。本綜述討論了這些二硫鍵變化對抗體結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和生物學(xué)功能的影響。

一、介紹

重組單克隆IgG抗體在蛋白質(zhì)治療劑中越來越被廣泛應(yīng)用。 IgG的二硫鍵結(jié)構(gòu)通過進(jìn)化高度保守，曾被認(rèn)為是均勻（uniform）和均一（homogeneous）的結(jié)構(gòu)特征。 然而，大量IgG分子的詳細(xì)表征揭示了重組和天然人IgG抗體中的幾種新結(jié)構(gòu)特征。 這些新發(fā)現(xiàn)及其對IgG結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和生物學(xué)功能的影響在這里進(jìn)行了綜述

二、 經(jīng)典的二硫鍵結(jié)構(gòu) Classical Disulfide Bond Structures

四個IgG亞類的二硫鍵結(jié)構(gòu)建立于20世紀(jì)60年代。這些二硫鍵結(jié)構(gòu)被稱為經(jīng)典的二硫鍵結(jié)構(gòu)，因為它們被廣泛接受。如圖1所示，關(guān)于IgG抗體IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的四個亞類中的二硫鍵結(jié)構(gòu)存在許多相似性和一些差異。每個IgG含有總共12個鏈內(nèi)二硫鍵；每個二硫鍵與個體IgG結(jié)構(gòu)域相關(guān)。兩條重鏈通過可變數(shù)目的二硫鍵在鉸鏈區(qū)（ hinge region ）連接：IgG1和IgG4為2，IgG2為4，IgG3為11。 IgG1的輕鏈通過輕鏈的最后半胱氨酸殘基和重鏈的第五個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵與重鏈連接。然而，對于IgG2，IgG3和IgG4，輕鏈通過輕鏈的最后半胱氨酸殘基和重鏈的第三半胱氨酸殘基之間的二硫鍵與重鏈連接。

鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵之間的溶劑暴露水平不同。 形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基位于鉸鏈區(qū)，除了IgG2，IgG3和IgG4中重鏈的第三個半胱氨酸殘基，其位于VH和CH1結(jié)構(gòu)域的界面之間.因此，inter鏈二硫鍵是高度溶劑暴露的。另一方面，鏈內(nèi)二硫鍵埋在每個區(qū)域內(nèi)的兩層反平行β-折疊結(jié)構(gòu)之間，并且沒有溶劑暴露。溶劑 暴露差異具有重要意義，因為暴露的半胱氨酸殘基被認(rèn)為比未暴露的半胱氨酸殘基更具反應(yīng)性。

三、 非經(jīng)典類 Non-Classical Linkage

已經(jīng)觀察到除了圖1中所示的經(jīng)典結(jié)構(gòu)之外的二硫鍵結(jié)構(gòu)，主要針對IgG2和IgG4，但針對IgG1和IgG3沒有觀察到。 僅觀察到少量的二硫鍵變體在IgG1的鏈內(nèi)形式的兩個重鏈間二硫鍵。 IgG3在鉸鏈區(qū)具有重復(fù)的氨基酸序列，并且總共有11個二硫鍵緊鄰 ，這對于形成二硫鍵變體不具有很大的靈活性。

IgG2的非經(jīng)典二硫鍵結(jié)構(gòu)首先在重組單克隆抗體（mAb）中鑒定，然后在人IgG2分子中得到證實。在這些出版物中，經(jīng)典的二硫鍵結(jié)構(gòu)被稱為IgG2A，而兩個主要的非結(jié)構(gòu)經(jīng)典結(jié)構(gòu)稱為IgG2B和IgG2-A / B，后者被認(rèn)為是IgG2A和IgG2B之間的結(jié)構(gòu)中間體（圖2）。不同二硫鍵異構(gòu)體的分布取決于輕鏈的類型，IgG2A是具有λ輕鏈的分子中的主要形式; IgG2B是κ輕鏈分子中的主要形式。在細(xì)胞培養(yǎng)，體外培養(yǎng)與血清和患者血清中觀察到從IgG2A形式到IgG2B的轉(zhuǎn)化。分子動力學(xué)模擬研究表明，硫原子在鏈二硫鍵具有高度流動性并且可以非常接近。因此，觀察多種二硫鍵同種型共存IgG2抗體并不令人驚訝。除了來自不同分子內(nèi)二硫鍵連接的同種型外，在來自細(xì)胞培養(yǎng)物和人血清的重組IgG2中也發(fā)現(xiàn)了二硫鍵連接的IgG2二聚體。

到目前為止，IgG4是最知名的具有非經(jīng)典二硫鍵結(jié)構(gòu)的IgG分子亞類（圖3）。幾個有趣的觀察結(jié)果導(dǎo)致了非經(jīng)典二硫鍵結(jié)構(gòu)的最終發(fā)現(xiàn)。首先，當(dāng)通過非還原十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析時，觀察到最明顯的IgG4為半分子，而不是通過在天然條件下運行尺寸排阻色譜（size-exclusion chromatography，SEC）看到的，表明兩個半分子通過非共價相互作用而不是通過共價鍵相關(guān)聯(lián)。其次，多克隆IgG4不能交聯(lián)抗原并且表現(xiàn)得像單價抗體，而單克隆IgG4可以交聯(lián)抗原。第三，作為共價連接單體的IgG4表現(xiàn)出血漿中的雙特異性。這些觀察結(jié)果表明，IgG4的兩個重鏈間二硫鍵與鏈內(nèi)二硫鍵形成平衡。IgG1和IgG4在中間鉸鏈區(qū)相差一個氨基酸，即IgG1中有兩個脯氨酸殘基和IgG4中的絲氨酸和脯氨酸殘基。通過用脯氨酸殘基取代絲氨酸殘基獲得穩(wěn)定的IgG4重鏈間二硫鍵。由于重鏈間二硫鍵的不穩(wěn)定性，可將對兩種不同抗原特異的等量的兩種重組IgG4抗體注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可在還原劑存在下體外形成雙特異性抗體。

IgG4二硫鍵同種型：

四、游離巰基 Free Sulfhydryls

據(jù)推測，IgG中的所有半胱氨酸殘基都處于二硫鍵連接狀態(tài)。然而，在IgG分子中常規(guī)檢測到游離巰基，包括來自血清和重組mAb的IgG（表1）。值得討論表1中的兩個重要觀察結(jié)果。首先，在變性（denaturing）下檢測到更高水平的游離巰基與天然（native）條件相比的條件。這表明游離巰基與鏈內(nèi)和鏈內(nèi)二硫鍵中涉及的半胱氨酸殘基相關(guān)。其次，在不同的研究中，在變性條件下游離巰基的水平存在很大差異。這種大的變異可能是由于多種因素的組合，包括不同的IgG類型（人或重組），不同的IgG亞類和實驗變異，例如變性試劑和變性時間，其可以針對不同的IgG變化以完全變性。二硫鍵可能降解發(fā)生產(chǎn)生游離巰基，這將在后面討論。

雖然IgG分子可能具有不同水平的游離巰基，但研究表明在結(jié)構(gòu)域中游離巰基的分布相似，至少在重組IgG1是這樣。輕鏈中可變結(jié)構(gòu)域具有比在恒定結(jié)構(gòu)域中更高水平的游離巰基。 CH3結(jié)構(gòu)域具有最高水平的游離巰基，其次是CH1，CH2和重鏈中的可變結(jié)構(gòu)域。最低水平的游離巰基與鏈間二硫鍵相關(guān)，表明低水平的游離巰基最可能是由于二硫鍵的不完全形成。因為具有較高溶劑暴露水。其他的分布是特殊的二硫鍵沒有有效生成的特例。

到目前為止，文獻(xiàn)報道了兩個特殊例子。 在這兩種情況下，重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的鏈內(nèi)二硫鍵未完全形成，其水平使得通過疏水相互作用或弱陽離子交換色譜檢測到具有這種不完全二硫鍵的抗體。通過向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加硫酸銅可以完全形成特殊二硫鍵，這表明細(xì)胞培養(yǎng)條件可以影響二硫鍵的形成。 在血清中體外孵育或從大鼠血清中回收的抗體，不完全的二硫鍵形成顯著的減少。

五、B-消除 β-Elimination

在一般條件下，二硫鍵可以通過β-消除機(jī)制分解，形成脫氫丙氨酸（dehydroalanine）和過硫化物（persulfide），可以進(jìn)一步恢復(fù)到半胱氨酸殘基。IgG的輕鏈和重鏈通過β-消除機(jī)制，二硫鍵的降解 ，隨后交聯(lián)所得的半胱氨酸和脫氫丙氨酸，導(dǎo)致形成不可還原的硫醚鍵，在4℃和高達(dá)13.6儲存的重組單克隆IgG1，發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)力樣品中比例為?0.4％。。 隨后的脫氫丙氨酸水解是除肽鍵水解之外的另一重要機(jī)制，其導(dǎo)致鉸鏈區(qū)中的抗體片段化

六 、 三硫鍵形成 Trisulfide Bond Formation

三硫鍵（Trisulfide bonding）形成是蛋白質(zhì)的罕見翻譯后修飾。首先報道了重組單克隆IgG2存在三硫鍵，其中四個重鏈間二硫鍵中的一個或兩個可能以三硫鍵形式存在。后來在重組IgG抗體的所有亞類中檢測到三硫鍵，以及在所有病例中，在通常形成輕鏈的半胱氨酸殘基和重鏈二硫鍵之間觀察到更高水平的三硫鍵。重組mAb中的三硫鍵被認(rèn)為是在發(fā)酵過程中形成的，由完整的二硫鍵與溶解的硫化氫（H2S）的反應(yīng)。這一結(jié)論得到了以下觀察結(jié)果的支持：IgG與H2S的孵育導(dǎo)致了更高水平的三硫鍵結(jié)合。當(dāng)重組IgG2抗體在pH 7.5和的各種還原試劑一起溫育時，三硫鍵大量轉(zhuǎn)化為二硫鍵。在另一項研究中，表明三硫鍵在pH 6.5的緩沖液和體外大鼠血清中是穩(wěn)定的。然而，當(dāng)在腹膜內(nèi)注射從大鼠血清中回收重組IgG1的24小時后，實現(xiàn)了三硫鍵完全轉(zhuǎn)化為二硫鍵。猜測，在適當(dāng)?shù)难趸€原條件下，HS對二硫鍵的初始親核攻擊，產(chǎn)生的幾種反應(yīng)中間體形成三硫鍵。

七、結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和功能 Structure, Stability and Functions

非經(jīng)典結(jié)構(gòu)和三硫鍵的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能影響的信息是有限的。 通過SEC和分析超速離心測定，IgG2B的非經(jīng)典結(jié)構(gòu)比IgG2A的結(jié)構(gòu)更緊湊。 IgG2A顯示出與IgG2B具有相似或更高的結(jié)合親和力和生物活性。研究確定存在 三硫鍵似乎不影響熱穩(wěn)定性或抗原結(jié)合。有關(guān)IgG4同種型(isoforms)的有限信息主要來自誘變研究。 兩個突變體，一個用絲氨酸替換第一個中間鉸鏈半胱氨酸，另一個用脯氨酸替換中間鉸鏈中的絲氨酸，導(dǎo)致更穩(wěn)定的IgG4分子而不影響抗原結(jié)合活性。在另一項研究中，替換中間鉸鏈絲氨酸 與脯氨酸結(jié)合導(dǎo)致更穩(wěn)定的鏈間二硫鍵和增加的半衰期，同樣不影響抗原結(jié)合活性。

使用單個結(jié)構(gòu)域以及完整的IgG分子研究了游離巰基對IgG的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性和生物學(xué)功能的影響。沒有完整的鏈內(nèi)二硫鍵的CL結(jié)構(gòu)域，CH3結(jié)構(gòu)域和單鏈可變片段的各個結(jié)構(gòu)域顯示出較低的穩(wěn)定性，但沒有實質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。預(yù)計其他結(jié)構(gòu)域中鏈內(nèi)二硫鍵的缺乏將具有類似的去穩(wěn)定作用，因為所有IgG結(jié)構(gòu)域具有相似的折疊。重組單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中二硫鍵的不完全形成導(dǎo)致效力的顯著降低。源自ABPC48小鼠漿細(xì)胞瘤的天然抗體，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的第二個半胱氨酸殘基被酪氨酸殘基取代，能夠結(jié)合抗原，進(jìn)一步表明完全二硫鍵不是抗原結(jié)合的先決條件。較高量的游離巰基導(dǎo)致重組和人IgG抗體的較低熱穩(wěn)定性。此外，與IgG1相比，IgG2的聚集傾向更高，歸因于IgG2的游離巰基水平更高

部分還原是研究鏈間二硫鍵對IgG結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和生物學(xué)功能影響的常用方法之一。盡管未觀察到全局構(gòu)象變化，但部分還原增加了鉸鏈區(qū)的柔性，可能是由于鏈間二硫鍵的減少，導(dǎo)致兩個CH2結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步分離。在部分還原和烷基化時也觀察到人IgG1，IgG2和IgG4的流體動力學(xué)大小明顯增加，但I(xiàn)gG3的大小減小，這再次歸因于鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化。高度依賴于實驗條件，部分減少要么沒有影響，要么降低補(bǔ)體激活效率。部分還原對Fc受體結(jié)合以及因此抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）的影響也不一致，例如，對于不同抗體沒有觀察到效果和活性顯著的降低。其中一個關(guān)鍵問題是不同研究中鏈內(nèi)二硫鍵的還原程度。據(jù)報道，只有人IgG1的鏈間二硫鍵易于在天然條件下還原。然而，天然條件下兔IgG的鏈內(nèi)二硫鍵可能減少。

盡管游離巰基的含量似乎很低，但它們的存在對重組單克隆抗體制劑提出了一些挑戰(zhàn)。發(fā)現(xiàn)大部分IgG1二聚體是由于形成分子間二硫鍵而形成的，這可能是由游離巰基形成的。在熱應(yīng)激后pH6.0時，通過二硫鍵形成的二聚化是重組單克隆IgG2抗體的主要聚集途徑。通過攪拌引起的聚集體中，也發(fā)現(xiàn)了大量通過IgG2的二硫鍵形成的共價連接的聚集體。具有不完全二硫鍵的抗體可能在各種脅迫條件下更容易解折疊，因此通過二硫鍵形成具有更高的共價聚集傾向。具有較高游離巰基水平的IgG抗體也具有更大的暴露疏水區(qū)域的傾向，這可通過分子間疏水相互作用驅(qū)動非共價聚集體的形成。

八、總結(jié)

由于翻譯后修飾，異質(zhì)性（Heterogeneity）是重組mAb的共同特征，并且與二硫鍵結(jié)構(gòu)特異性相關(guān)的變異（variation）是異質(zhì)性的潛在主要貢獻(xiàn)者。 已經(jīng)清楚地證明，在抗體裝配后，鏈內(nèi)二硫鍵通常更穩(wěn)定。 因此，與這些鏈內(nèi)二硫鍵相關(guān)的低水平游離巰基，可能是由于二硫鍵的不完全形成。 另一方面，鏈間二硫鍵暴露并且不太穩(wěn)定，這解釋了為什么增加的異質(zhì)性與這些鍵相關(guān)聯(lián)。 因此，假設(shè)在抗體裝配后可能發(fā)生非經(jīng)典的二硫鍵結(jié)構(gòu)，三硫鍵和硫醚鍵形成是合理的。

由于觀察到結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化，因此在重組mAb的開發(fā)過程中應(yīng)該密切關(guān)注這些新的二硫鍵相關(guān)結(jié)構(gòu)。 從理論上講，向人類施用非天然二硫鍵結(jié)構(gòu)有可能引發(fā)免疫反應(yīng)。 降低穩(wěn)定性還可以最終導(dǎo)致非天然結(jié)構(gòu)，因為更高的展開傾向和形成聚集體。 因此，需要更多實驗來提高對二硫鍵相關(guān)結(jié)構(gòu)變體對IgG分子的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的影響的理解。