Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)，被認為是第三代測序技術(shù)。與前兩代技術(shù)相比，他們最大的特點是單分子測序，其中，Heliscope技術(shù)和SMRT技術(shù)利用熒光信號進行測序，而納米孔單分子測序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號進行測序。
“第三代基因測序技術(shù)”的方法原理
PacBio SMRT技術(shù)應(yīng)用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT芯片為測序載體，芯片上有很多小孔，每個孔中均有DNA聚合酶。測序基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標記4種堿基（即是dNTP），在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對其造成的損傷所影響。另外，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約數(shù)個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通病），達到15%，但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯（代價是重復測序，也就是成本會增加）。
Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，設(shè)計了一種特殊的納米孔（只能容納單分子通過），孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。當DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。
“基因測序技術(shù)”的發(fā)展歷史
1986年，第一臺商用基因測序設(shè)備出現(xiàn)，間隔19年，第二代測序設(shè)備出現(xiàn)，從第二代設(shè)備到第三代設(shè)備只用了5年，說明基因測序設(shè)備更新?lián)Q代速度加快。第一代測序技術(shù)，主要基于 Sanger雙脫氧終止法的測序原理，結(jié)合熒光標記和毛細管陣列電泳技術(shù)來實現(xiàn)測序的自動化，基本方法是鏈終止或降解法，人類基因組計劃就是基于一代測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)，早期代表平臺包括 Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid、羅氏的454平臺等，目前二代測序設(shè)備在通量、準確度上都有了較大的提高，同時測序成本也隨之大幅度下降，成為商用測序的主流。第三代測序技術(shù)又稱為單分子 DNA 測序，即通過現(xiàn)代光學、高分子、納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號差異的原理，以達到直接讀取序列信息的目的，三代測序設(shè)備在DNA 序列片段讀長上優(yōu)于二代設(shè)備，但在準確度上較二代設(shè)備差，未來隨著技術(shù)的改善，三代測序設(shè)備將更為穩(wěn)定和成熟。
“第三代基因測序技術(shù)”的優(yōu)勢與劣勢
相比于二代測序，三代測序具有如下優(yōu)勢：
1）第三代基因測序讀長較長，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均讀長達到 10kb，可以減少生物信息學中的拼接成本，也節(jié)省了內(nèi)存和計算時間。
2）直接對原始DNA樣本進行測序，從作用原理上避免了 PCR 擴增帶來的出錯。
3）拓展了測序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，二代測序技術(shù)大部分應(yīng)用基于DNA，三代測序還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的：第一個是直接測RNA的序列，RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶復制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同，根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。
4）三代測序在ctDNA，單細胞測序中具有很大的優(yōu)勢：ctDNA含量非常低，三代測序技術(shù)靈敏度高，能夠?qū)τ?ng以下做到監(jiān)測；在單細胞級別：二代測序要把DNA提取出來打碎測序，三代測序直接對原始DNA測序，細胞裂解原位測序，是三代測序的殺手應(yīng)用。
第三代基因測序也存在一定的缺陷：
1）總體上單讀長的錯誤率依然偏高，成為限制其商業(yè)應(yīng)用開展的重要原因；第三代基因測序技術(shù)目前的錯誤率在15%-40%，極大地高于二代測序技術(shù)NGS的錯誤率（低于1%）。不過好在三代的錯誤是完全隨機發(fā)生的，可以靠覆蓋度來糾錯（但這要增加測序成本）。
2）三代測序技術(shù)依賴DNA聚合酶的活性。
3）成本較高，二代Illumina的測序成本是每100萬個堿基0.05-0.15美元，三代測序成本是每100萬個堿基0.33-1.00美元。
4）生信分析軟件也不夠豐富。
“第三代基因測序技術(shù)”國內(nèi)外的布局的公司
國外布局三代測序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015 年 10 月 27 日，國內(nèi)公司瀚?；―irectGenomics）公布了基于 Helicos 技術(shù)研發(fā)的專門用于臨床的第三代單分子測序儀 GenoCare 原理樣機。中科院北京基因組研究所與浪潮基因組科學也在共同研制國產(chǎn)第三代基因測序儀。在測序儀價格方面，PACBIO 2011年的第一臺三代測序儀PacBio RS在美國價格80萬美金，2015年生產(chǎn)的sequel測序儀價格35萬美金，大幅下降。在測序成本方面，預計未來5年內(nèi)三代測序能達到100美元全基因組測序的價格。
