Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù),被認為是第三代測序技術(shù)。與前兩代技術(shù)相比,他們最大的特點是單分子測序,其中,Heliscope技術(shù)和SMRT技術(shù)利用熒光信號進行測序,而納米孔單分子測序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號進行測序。
“第三代基因測序技術(shù)”的方法原理
PacBio SMRT技術(shù)應(yīng)用了邊合成邊測序的思想,并以SMRT芯片為測序載體,芯片上有很多小孔,每個孔中均有DNA聚合酶。測序基本原理是: DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標記4種堿基(即是dNTP),在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。另外,可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間,來檢測一些堿基修飾情況,既如果堿基存在修飾,則通過聚合酶時的速度會減慢,相鄰兩峰之間的距離增大,可以通過這個來之間檢測甲基化等信息。SMRT技術(shù)的測序速度很快,每秒約數(shù)個dNTP。但是,同時其測序錯誤率比較高(這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通病),達到15%,但好在它的出錯是隨機的,并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向,因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯(代價是重復測序,也就是成本會增加)。
Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同,它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是,設(shè)計了一種特殊的納米孔(只能容納單分子通過),孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。當DNA堿基通過納米孔時,它們使電荷發(fā)生變化,從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的),靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。
“基因測序技術(shù)”的發(fā)展歷史
1986年,第一臺商用基因測序設(shè)備出現(xiàn),間隔19年,第二代測序設(shè)備出現(xiàn),從第二代設(shè)備到第三代設(shè)備只用了5年,說明基因測序設(shè)備更新?lián)Q代速度加快。第一代測序技術(shù),主要基于 Sanger雙脫氧終止法的測序原理,結(jié)合熒光標記和毛細管陣列電泳技術(shù)來實現(xiàn)測序的自動化,基本方法是鏈終止或降解法,人類基因組計劃就是基于一代測序技術(shù)。第二代測序技術(shù),早期代表平臺包括 Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid、羅氏的454平臺等,目前二代測序設(shè)備在通量、準確度上都有了較大的提高,同時測序成本也隨之大幅度下降,成為商用測序的主流。第三代測序技術(shù)又稱為單分子 DNA 測序,即通過現(xiàn)代光學、高分子、納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號差異的原理,以達到直接讀取序列信息的目的,三代測序設(shè)備在DNA 序列片段讀長上優(yōu)于二代設(shè)備,但在準確度上較二代設(shè)備差,未來隨著技術(shù)的改善,三代測序設(shè)備將更為穩(wěn)定和成熟。
“第三代基因測序技術(shù)”的優(yōu)勢與劣勢
相比于二代測序,三代測序具有如下優(yōu)勢:
1)第三代基因測序讀長較長,如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均讀長達到 10kb,可以減少生物信息學中的拼接成本,也節(jié)省了內(nèi)存和計算時間。
2)直接對原始DNA樣本進行測序,從作用原理上避免了 PCR 擴增帶來的出錯。
3)拓展了測序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,二代測序技術(shù)大部分應(yīng)用基于DNA,三代測序還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的:第一個是直接測RNA的序列,RNA的直接測序,將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶復制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板,DNA聚合酶停頓的時間不同,根據(jù)這個不同的時間,可以判斷模板的C是否甲基化。
4)三代測序在ctDNA,單細胞測序中具有很大的優(yōu)勢:ctDNA含量非常低,三代測序技術(shù)靈敏度高,能夠?qū)τ?ng以下做到監(jiān)測;在單細胞級別:二代測序要把DNA提取出來打碎測序,三代測序直接對原始DNA測序,細胞裂解原位測序,是三代測序的殺手應(yīng)用。
第三代基因測序也存在一定的缺陷:
1)總體上單讀長的錯誤率依然偏高,成為限制其商業(yè)應(yīng)用開展的重要原因;第三代基因測序技術(shù)目前的錯誤率在15%-40%,極大地高于二代測序技術(shù)NGS的錯誤率(低于1%)。不過好在三代的錯誤是完全隨機發(fā)生的,可以靠覆蓋度來糾錯(但這要增加測序成本)。
2)三代測序技術(shù)依賴DNA聚合酶的活性。
3)成本較高,二代Illumina的測序成本是每100萬個堿基0.05-0.15美元,三代測序成本是每100萬個堿基0.33-1.00美元。
4)生信分析軟件也不夠豐富。
“第三代基因測序技術(shù)”國內(nèi)外的布局的公司
國外布局三代測序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司,2015 年 10 月 27 日,國內(nèi)公司瀚?;―irectGenomics)公布了基于 Helicos 技術(shù)研發(fā)的專門用于臨床的第三代單分子測序儀 GenoCare 原理樣機。中科院北京基因組研究所與浪潮基因組科學也在共同研制國產(chǎn)第三代基因測序儀。在測序儀價格方面,PACBIO 2011年的第一臺三代測序儀PacBio RS在美國價格80萬美金,2015年生產(chǎn)的sequel測序儀價格35萬美金,大幅下降。在測序成本方面,預計未來5年內(nèi)三代測序能達到100美元全基因組測序的價格。