顯 微 鏡 知 識
我們的眼睛能看到數(shù)百萬光年外的星系，卻不一定能看到眼前細(xì)小的物體。在大尺度上觀察物質(zhì)的運(yùn)動，毫無疑問能得到強(qiáng)烈的美感。那么從極其微小的尺度上呢？威廉·布萊克在一首詩中寫道：
一花一世界，
一沙一天堂，
掌中握無限，
霎那成永恒。
——《天真的預(yù)言》（Auguries of Innocence），1863
如果除去其中的神秘主義和宗教意味，那么這首詩恰好與微觀世界的某些特點(diǎn)不謀而合。例如一朵花包含數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞，而一粒沙確實(shí)是由無數(shù)的氧原子和硅原子組成的(SiO2)。
不過，即使把一朵花握于掌中，你也決不會肉眼分辨出其中的“世界”。一個視力正常的人，只能看清大約25厘米之外的物體，如果繼續(xù)靠近，晶狀體就無法把物體的像正確的投影在視網(wǎng)膜上。即使在25厘米的明視距離上，你也只擁有1分的分辨率?；蛘哒f，在這個距離上，你恰好能把兩條相距0.075毫米的線分開。從生物學(xué)的角度可以解釋這種現(xiàn)象。當(dāng)兩條線的距離小于0.075毫米的時(shí)候，它們的像就會落在視網(wǎng)膜的同一個視覺感受器——視錐細(xì)胞或者視桿細(xì)胞——上面。那么你就沒法把它們分辨開來。
很早以前，人們就知道某些光學(xué)裝置能夠“放大”物體。比如在《墨經(jīng)》里面就記載了能放大物體的凹面鏡。至于凸透鏡是什么時(shí)候發(fā)明的，可能已經(jīng)無法考證。凸透鏡——有的時(shí)候人們把它稱為“放大鏡”——能夠聚焦太陽光，也能讓你看到放大后的物體，這是因?yàn)橥雇哥R能夠把光線偏折。你通過凸透鏡看到的其實(shí)是一種幻覺，嚴(yán)格的說，叫做虛像。當(dāng)物體發(fā)出的光通過凸透鏡的時(shí)候，光線會以特定的方式偏折。當(dāng)我們看到那些光線的時(shí)候，或不自覺地認(rèn)為它們?nèi)匀皇茄毓P直的路線傳播。結(jié)果，物體就會看上去比原來大。
單個凸透鏡能夠把物體放大幾十倍，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以讓我們看清某些物體的細(xì)節(jié)。公元13世紀(jì)，出現(xiàn)了為視力不濟(jì)的人準(zhǔn)備的眼鏡——一種玻璃制造的透鏡片。隨著籠罩歐洲一千年的黑暗消失，各種新的發(fā)明紛紛涌現(xiàn)出來，顯微鏡（microscope）就是其中的一個。大約在16世紀(jì)末，荷蘭的眼鏡商詹森（Zaccharias Janssen）和他的兒子把幾塊鏡片放進(jìn)了一個圓筒中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過圓筒看到附近的物體出奇的大，這就是現(xiàn)在的顯微鏡和望遠(yuǎn)鏡的前身。
據(jù)說，幾百年前列文虎克把他制作顯微鏡的技術(shù)視為秘密。今天，顯微鏡——至少是光學(xué)顯微鏡——已經(jīng)成了一種非常普通的工具，讓我們了解這個小小的大千世界。
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復(fù)合式顯微鏡
詹森制造的是第一臺復(fù)合式顯微鏡。使用兩個凸透鏡，一個凸透鏡把另外一個所成的像進(jìn)一步放大，這就是復(fù)合式顯微鏡的基本原理。如果兩個凸透鏡一個能放大10倍，另一個能放大20倍，那么整個鏡片組合的的放大倍數(shù)就是10*20=200倍。
1665年，英國科學(xué)家羅伯特·胡克（人們可能更熟悉他的另一個發(fā)現(xiàn)：胡克定律）用他的顯微鏡觀察軟木切片的時(shí)候，驚奇的發(fā)現(xiàn)其中存在著一個一個“單元”結(jié)構(gòu)。胡克把它們稱作“細(xì)胞”。不過，詹森時(shí)代的復(fù)合式顯微鏡并沒有真正顯示出它的威力，它們的放大倍數(shù)低得可憐。荷蘭人安東尼·馮·列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek ，1632-1723)制造的顯微鏡讓人們大開眼界。列文虎克自幼學(xué)習(xí)磨制眼鏡片的技術(shù)，熱衷于制造顯微鏡。他制造的顯微鏡其實(shí)就是一片凸透鏡，而不是復(fù)合式顯微鏡。不過，由于他的技藝精湛，磨制的單片顯微鏡的放大倍數(shù)將近300倍，超過了以往任何一種顯微鏡。
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羅伯特·虎克的顯微鏡
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列文虎克的顯微鏡
當(dāng)列文虎克把他的顯微鏡對準(zhǔn)一滴雨水的時(shí)候，他驚奇的發(fā)現(xiàn)了其中令人驚嘆的小小世界：無數(shù)的微生物游曳于其中。他把這個發(fā)現(xiàn)報(bào)告給了英國皇家學(xué)會，引起了一陣轟動。人們有時(shí)候把列文虎克稱為“顯微鏡之父”，嚴(yán)格的說，這不太正確。列文虎克沒有發(fā)明第一個復(fù)合式顯微鏡，他的成就是制造出了高質(zhì)量的凸透鏡鏡頭。
在接下來的兩個世紀(jì)中，復(fù)合式顯微鏡得到了充分的完善，例如人們發(fā)明了能夠消除色差（當(dāng)不同波長的光線通過透鏡的時(shí)候，它們折射的方向略有不同，這導(dǎo)致了成像質(zhì)量的下降）和其他光學(xué)誤差的透鏡組。與19世紀(jì)的顯微鏡相比，現(xiàn)在我們使用的普通光學(xué)顯微鏡基本上沒有什么改進(jìn)。原因很簡單：光學(xué)顯微鏡已經(jīng)達(dá)到了分辨率的極限。
如果僅僅在紙上畫圖，你自然能夠“制造”出任意放大倍數(shù)的顯微鏡。但是光的波動性將毀掉你完美的發(fā)明。即使消除掉透鏡形狀的缺陷，任何光學(xué)儀器仍然無法完美的成像。人們花了很長時(shí)間才發(fā)現(xiàn)，光在通過顯微鏡的時(shí)候要發(fā)生衍射——簡單的說，物體上的一個點(diǎn)在成像的時(shí)候不會是一個點(diǎn)，而是一個衍射光斑。如果兩個衍射光斑靠得太近，你就沒法把它們分辨開來。顯微鏡的放大倍數(shù)再高也無濟(jì)于事了。對于使用可見光作為光源的顯微鏡，它的分辨率極限是0.2微米。任何小于0.2微米的結(jié)構(gòu)都沒法識別出來。
暗視場顯微鏡
在日常生活中，室內(nèi)空氣里的微?；覊m是不容易看見的，但在黑暗的房間中，若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來，灰塵微粒便粒粒可見了，這就是光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象，這也是在白天我們不能而在夜晚就能清晰地看到天上星星的原因。暗視場顯微鏡 就是利用此原理設(shè)計(jì)的，觀察血細(xì)胞的清晰度比普通亮背景顯微鏡有了大大提高，以暗視 場顯微鏡所看到的是襯托在黑背景中發(fā)亮的細(xì)胞輪廓及其細(xì)節(jié)。顯微鏡的最高分辨率為0.2微米，而暗視場顯微鏡 能大大提高樣品的細(xì)節(jié)構(gòu)造分辨率，可看到0.004微米以上微細(xì)顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來觀察微細(xì)的顆粒與細(xì)菌等。在醫(yī)學(xué)、林業(yè)、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域研究中有著廣泛用途。
暗視場顯微鏡觀察 相差顯微鏡觀察
相差顯微鏡
相差顯微鏡的基本原理是通過儀器，把透過顯微標(biāo)本的可見光的相位差變成振幅差，從而大大提高了標(biāo)本內(nèi)顯微結(jié)構(gòu)間的對比度，使標(biāo)本結(jié)構(gòu)更加清晰可辨。是介于光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡之間的一種顯微檢查技術(shù)，用于觀察生活細(xì)胞或未經(jīng)染色細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。生物細(xì)胞無色透明，細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)間的反差很小，在一般光學(xué)顯微鏡下難以清晰觀察到細(xì)胞的輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，必須使用相差顯微鏡
顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡，最重要的指標(biāo)是清晰度要高。沒有清晰度，放大倍數(shù)便毫無意義，這取決于光學(xué)系統(tǒng)，顯微系統(tǒng)雖然都是由物鏡目鏡組成，但是系統(tǒng)不同 ,效果大不相同，就好象普通電視和數(shù)字電視，都可以看，檔次效果卻不一般。目前各種顯微鏡主要分二大類型光學(xué)系統(tǒng)：
1、有限遠(yuǎn)顯微光學(xué)系統(tǒng)——普通。
2、無限遠(yuǎn)顯微光學(xué)系統(tǒng)——清晰度高，國外如德國、日本、美國的儀器設(shè)計(jì)采用。
電子顯微鏡
提高顯微鏡分辨率的途徑之一就是設(shè)法減小光的波長，或者，用電子束來代替光。根據(jù)德布羅意的物質(zhì)波理論，運(yùn)動的電子具有波動性，而且速度越快，它的“波長”就越短。如果能把電子的速度加到足夠高，并且匯聚它，就有可能用來放大物體。
1938年，德國工程師Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一臺透射電子顯微鏡（TEM）。1952年，英國工程師Charles Oatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡（SEM）。電子顯微鏡是20世紀(jì)最重要的發(fā)明之一。由于電子的速度可以加到很高，電子顯微鏡的分辨率可以達(dá)到納米級（10-9m）。很多在可見光下看不見的物體——例如病毒——在電子顯微鏡下現(xiàn)出了原形。
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（電子顯微鏡下的蚊子）
掃描隧道顯微鏡
用電子代替光，這或許是一個反常規(guī)的主意。但是還有更令人吃驚的。1983年，IBM公司蘇黎世實(shí)驗(yàn)室的兩位科學(xué)家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer發(fā)明了所謂的掃描隧道顯微鏡（STM）。這種顯微鏡比電子顯微鏡更激進(jìn)，它完全失去了傳統(tǒng)顯微鏡的概念。
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諾貝爾獎：Ernst Ruska，Gerd Binnig和Heinrich Rohrer（從左至右）
分別因?yàn)榘l(fā)明電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡而分享1986年的諾貝爾物理學(xué)獎
很顯然，你不能直接“看到”原子。因?yàn)樵优c宏觀物質(zhì)不同，它不是光滑的、滴溜亂轉(zhuǎn)的削球，更不是達(dá)·芬奇繪畫時(shí)候所用的模型。掃描隧道顯微鏡依靠所謂的“隧道效應(yīng)”工作。如果舍棄復(fù)雜的公式和術(shù)語，這個工作原理其實(shí)很容易理解。隧道掃描顯微鏡沒有鏡頭，它使用一根探針。探針和物體之間加上電壓。如果探針距離物體表面很近——大約在納米級的距離上——隧道效應(yīng)就會起作用。電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。如果探針與物體的距離發(fā)生變化，這股電流也會相應(yīng)的改變。這樣，通過測量電流我們就能知道物體表面的形狀，分辨率可以達(dá)到單個原子的級別。
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掃描隧道顯微鏡：圖中的“IBM”是由單個原子構(gòu)成的
因?yàn)檫@項(xiàng)奇妙的發(fā)明，Binnig和Rohrer獲得了1986年的諾貝爾物理學(xué)獎。這一年還有一個人分享了諾貝爾物理學(xué)獎，那就是電子顯微鏡的發(fā)明者Ruska。
顯 微 鏡 的 調(diào) 整
為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微攝象過程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。尤其是多功能高倍顯微鏡，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面簡述調(diào)試及使用方法。
1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整 為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時(shí)，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可靠結(jié)果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過程中不時(shí)地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項(xiàng)內(nèi)容：
(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整
① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔住），以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。
② 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“──”）使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲左右位置合適。
(2) 光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正 目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。
(3) 庫勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整 顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應(yīng)該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。
庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。 調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時(shí)在底片形成灰霧。 庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應(yīng)特別注意：
a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而
b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；
c. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題，在實(shí)際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌，但作顯微照相時(shí)，為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應(yīng)在使用每一個倍數(shù)的物鏡時(shí)，把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的視場光闌事先調(diào)整好，并作好記號，以后使用時(shí)根據(jù)記號直接調(diào)至相應(yīng)的位置。
(4) 孔徑光闌的正確使用 由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時(shí)應(yīng)掌握正確的使用方法。過去由于對孔徑光闌的認(rèn)識不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應(yīng)盡可能避免。
為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時(shí)，尤其在作顯微照相時(shí)獲得最佳分辨率，在每換用一個倍數(shù)的物鏡時(shí)，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。
2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要
顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。
(1) 透射光明視野（brightfield）
這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應(yīng)用方法。 基本部件：
a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；
b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。
調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。
適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。
注意事項(xiàng)：
a. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好；
b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中；
c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；
d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。
(2) 落射光激發(fā)的熒光法（簡稱為落射熒光法）
是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。
熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。
顯微鏡的保養(yǎng)
顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，價(jià)格普遍較高。從結(jié)構(gòu)上看，顯微鏡由許多光學(xué)部件和較精密的金屬零件組成，在使用過程中應(yīng)特別注意做好保養(yǎng)工作。
1. 嚴(yán)格按照有關(guān)操作規(guī)則使用顯微鏡，避免因使用不當(dāng)造成損毀。
2. 顯微鏡在儲存和使用過程中，普遍存在著生霉起霧問題，霉和霧會使顯微鏡的視場模糊，分辯率下降。為了使顯微鏡保持良好的工作狀態(tài)，延長使用壽命，顯微鏡的工作環(huán)境應(yīng)保持清潔、干燥、防塵。
3. 顯微鏡在每次使用完畢后應(yīng)及時(shí)做好清潔工作，特別是目鏡、物鏡等容易污染的光學(xué)部件，如發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)表面有灰塵、指紋、臟物等，應(yīng)及時(shí)用鏡頭紙清潔干凈。
4. 顯微鏡工作室最好能安裝空調(diào)、抽濕及防塵裝置。
5. 如發(fā)現(xiàn)光學(xué)部件內(nèi)部有生霉等現(xiàn)象，最好及時(shí)聯(lián)系廠家派人清潔、維修。
