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ELISA實(shí)驗(yàn)操作視頻
Experimental operation video
ELISA因其敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于臨床或科研中抗原和抗體的檢測(cè)。ELISA 實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡單，但小實(shí)驗(yàn)蘊(yùn)含大道理，細(xì)節(jié)稍不注意很容易產(chǎn)生假陽性或假陰性。接下來，博士德將以預(yù)實(shí)驗(yàn)的方式為大家演示ELISA具體實(shí)驗(yàn)操作過程。
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ELISA實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
matters needing attention
1.實(shí)驗(yàn)前
1) 確認(rèn)移液器是否校準(zhǔn)
2) 確認(rèn)各個(gè)儀器設(shè)備是否正常運(yùn)行
3) 檢查試劑盒各個(gè)組分和規(guī)格是否與說明書一致
2.預(yù)實(shí)驗(yàn)
1) 建議標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本一起做
2) 樣本可在不同組別中挑選具有代表性的樣本
3) 預(yù)估樣本含量，可采用1:1/1:10/1:100等稀釋比做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定樣本稀釋比例
3.標(biāo)準(zhǔn)品溶解
1) 推薦使用漩渦器
2) 反復(fù)顛倒混勻
3) 溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品按說明書進(jìn)行保存
4.加樣
1) 推薦使用排槍
2) 提高加樣速度，避免板子干燥時(shí)間太長
3) 避免出現(xiàn)太多氣泡
5.孵育
1) 嚴(yán)格按照說明溫度和時(shí)間進(jìn)行孵育
2) 避免板子疊加孵育
3) 每次都需要使用新的封板膜進(jìn)行孵育，避免交叉污染
6.洗板
1) 推薦使用自動(dòng)洗板機(jī)洗板
2) 人工洗板時(shí)，每次板孔盡量拍干
3) 每孔至少保證300ul洗液量
7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
1) 建議采用四參數(shù)曲線對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合
2) 曲線R值一般不低于兩個(gè)9
3) 可使用擬合軟件
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ELISA標(biāo)本處理方法
Sample processing method
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液）、細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞、組織等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定，有些則需經(jīng)預(yù)處理。
1.血清
室溫血液自然凝固 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
2.血漿
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇 EDTA 、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入 10 ％（ v/v ）抗凝劑 ( 0.1M 檸檬酸鈉或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形 成，應(yīng)再次離心。
3.尿液、胸腹水、腦脊液
用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的 成份時(shí)，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬 /ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5.細(xì)胞
檢測(cè)細(xì)胞的成份時(shí)，對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞10 秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍.加入適量裂解液, 用槍吹打把細(xì)胞吹散。用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g離心3-5 分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)操作。
6.組織標(biāo)本
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS或組織蛋白萃取試劑，緩沖液中可加入蛋白酶抑制劑。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清置于 -20 度或 - 70 度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
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ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題
Frequently Asked Questions
1.信號(hào)弱
可能原因 | 解決方法 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品配制不正確 | 標(biāo)準(zhǔn)品加稀釋液后充分溶解，并在指定時(shí)間內(nèi)使用 |
| 加入孔內(nèi)的試劑量不足 | 檢查移液槍的功能，必要時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。確保槍頭和槍緊密結(jié)合 |
| 抗原抗體反應(yīng)不夠充分 | 延長反應(yīng)時(shí)間，確保在最適溫度下進(jìn)行 |
| 試劑過期 | 檢查試劑盒有效期，不使用過期試劑 |
| 酶標(biāo)儀濾光片不匹配 | 檢查酶標(biāo)儀設(shè)置及濾光片 |
| 試劑盒平衡不充分 | 確保試劑盒在使用前平衡至室溫 |
| 顯示時(shí)間不夠 | 增加底物顯色時(shí)間 |
2.背景高
可能原因 | 解決方法 |
| 顯色時(shí)間過長沒及時(shí)終止 | 控制顯色時(shí)間，及時(shí)終止反應(yīng) |
| 反應(yīng)溫度過高導(dǎo)致的非特異性吸附 | 嚴(yán)格控制反應(yīng)在最適溫度下進(jìn)行 |
| 洗板不充分 | 增加洗滌次數(shù) 延長洗液浸泡時(shí)間 確保洗滌前棄去所有殘留溶液 |
3.無信號(hào)
可能原因 | 解決方法 |
| 檢測(cè)抗體、ABC、顯色液漏加或加試劑順序出錯(cuò) | 檢測(cè)試驗(yàn)操作流程，復(fù)核試劑添加順序，重復(fù)試驗(yàn) |
| 抗體用量不足 | 檢查抗體稀釋倍數(shù)是否正確 |
| 酶被疊氮鈉污染 | 使用新配制的試劑 |
| 同時(shí)操作兩盒及以上試劑盒時(shí)，試劑盒中試劑或酶標(biāo)板混淆 | 試驗(yàn)過程中，做好記錄，避免試劑或酶標(biāo)板混淆 |
4.梯度稀釋時(shí)出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象
可能原因 | 解決方法 |
| 酶標(biāo)板疊放 | 避免酶標(biāo)板疊放 |
| 梯度稀釋時(shí)不準(zhǔn)確 | 確定移液槍精準(zhǔn)，梯度稀釋操作正確 |
| 蒸發(fā) | 孵育時(shí)用封板膜封閉或加蓋板 |
| 洗板不均勻 | 確定洗板機(jī)正常工作 |
| 酶標(biāo)板底有雜物或水珠 | 讀數(shù)時(shí)清理干凈酶標(biāo)板底部 |
5.標(biāo)曲佳但樣本孔無信號(hào)或信號(hào)偏高
可能原因 | 解決方法 |
| 樣本含量低或樣本中無檢測(cè)物 | 設(shè)置陽性對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn) |
| 樣本基質(zhì)遮蓋檢測(cè) | 選擇合適稀釋倍數(shù)，重新稀釋樣本再測(cè) |
| 樣本中待測(cè)物超過標(biāo)曲范圍 | 選擇合適稀釋倍數(shù)，重新稀釋樣本再測(cè) |
6.邊緣效應(yīng)
可能原因 | 解決方法 |
| 孵育溫度不均衡 | 避免在環(huán)境溫度變化大的地方孵育 |
| 蒸發(fā) | 確保孵育時(shí)封閉完好 |
| 酶標(biāo)板疊放 | 避免酶標(biāo)板疊放 |
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博士德ELISA產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
Product advantages
1.靈敏度
ELISA試劑盒可檢測(cè)低濃度的蛋白，檢測(cè)能力可達(dá)到pg/mL，保證蛋白檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
24個(gè)健康人的血清樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，利用Human IL-1 beta ELISA Kit（EK0392)檢測(cè)24個(gè)正常人血清樣本。
2.特異性
只檢測(cè)目標(biāo)分析物，每個(gè)試劑盒都經(jīng)過廣泛的相關(guān)分子的交叉反應(yīng)測(cè)試，確保無交叉反應(yīng)和干擾。
選擇和HUMAN FOLR2 相關(guān)的蛋白，進(jìn)行特異性分析，用遠(yuǎn)高于檢測(cè)限的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)試分析。
3.穩(wěn)定性
不同批次的ELISA試劑盒在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)保證批間CV值小于10%。
三個(gè)不同濃度Mouse TNFα的樣本（不同顏色線），用4個(gè)不同批次持續(xù)12個(gè)月檢測(cè)。
4.回收率
通過回收實(shí)驗(yàn)測(cè)試確認(rèn)試劑盒是否受干擾因子的影響。
將高、中、低3個(gè)不同濃度的分析物加入到對(duì)應(yīng)的樣本(血清、血漿、細(xì)胞上清)中檢測(cè)，并計(jì)算蛋白的回收率，回收率標(biāo)準(zhǔn)一般是80%-120%。
5.蛋白定量
ELISA 試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品并不是簡單的質(zhì)量定量，不同廠家使用的標(biāo)定方法也各種差異。博士德參考了 WHO 國際標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行了校正。
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