CRISPR-Cas9 系統(tǒng)主要由兩個(gè)部分組成，一個(gè)可以辨識(shí)特定基因序列的引導(dǎo)RNA 分子，和一個(gè)具有分子剪刀特性的 Cas9 酵素，引導(dǎo)RNA 分子讓 Cas9 酵素與特定基因序列結(jié)合，進(jìn)而剪斷DNA。此特性提供想要借由破壞特定基因來(lái)研究其功能的科學(xué)家一個(gè)威力強(qiáng)大的工具。同時(shí)配合提供特定的修復(fù)模版，使基因以不同方式修復(fù)，可以讓研究者在任何基因體特定位置放入任何一段新序列。
2012年，當(dāng)大家正致力于利用此工具剪斷人類基因時(shí)，加州大學(xué)舊金山分校系統(tǒng)生物學(xué)家Jonathan Weissman 所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)卻有不一樣的做法: 破壞分子剪刀。Stanley Qi 將 Cas9 酵素加以突變(mutate)(注1)，使其雖然可以結(jié)合至引導(dǎo) RNA 所辨識(shí)的基因序列，卻失去將其切斷的功能，同時(shí)誘變的 Cas9 酵素阻擋了其他轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)與此特定基因結(jié)合，形同在不影響與改變DNA 序列的狀況下關(guān)掉此特定基因的基因表現(xiàn)。科學(xué)家不滿足止步于此，他們更進(jìn)一步再將可以活化基因表現(xiàn)的蛋白質(zhì)接到這被破壞的剪刀 (誘變Cas9 酵素)上，讓特定基因表現(xiàn)得以被活化，建立了一套在不影響塬DNA 序列狀況下，可以自由打開(kāi)或關(guān)閉基因表現(xiàn)的系統(tǒng)。數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)也陸續(xù)發(fā)表了更多成果，甚至可在同一實(shí)驗(yàn)中調(diào)控叁個(gè)或更多的基因，應(yīng)用于復(fù)雜生物機(jī)制的研究。
(二)CRISPR 非遺傳性的調(diào)控 (CRISPR EPIGENETICS)
從事基因療法研究的荷蘭遺傳學(xué)家 Marianne Rot，一開(kāi)始致力于尋找造成疾病的突變基因，但是后來(lái)發(fā)現(xiàn)更多疾病是來(lái)自基因表現(xiàn)受到干擾，而非源于單一的基因突變。她認(rèn)為最好控制基因活性的方法，就是調(diào)控基因表現(xiàn)。組蛋白(histones) 是纏繞包裹DNA 的蛋白質(zhì)，組蛋白包裹 DNA 的程度會(huì)影響到其他到蛋白質(zhì)靠近DNA的情形，且組蛋白與DNA的結(jié)合程度會(huì)隨著個(gè)體發(fā)育和環(huán)境而改變?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)：從大腦活動(dòng)到腫瘤生長(zhǎng)，都和基因序列以外的調(diào)控有關(guān)，但是研究的瓶頸在于無(wú)法改變特定基因位置的標(biāo)記。CRISPR-Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)，讓這個(gè)研究瓶頸看到解套的曙光。2015年Charles Gersbach 成功地將一個(gè)可以將乙酰基接到組蛋白上的酵素接在失去剪斷 DNA 功能的 Cas9 酵素上，再借由引導(dǎo) RNA 將此酵素帶至目標(biāo)基因，進(jìn)而影響該基因的表現(xiàn)。
(叁)CRISPR 破解密碼 (CRISPR CODE CRACKING)
超過(guò)98%的人類DNA和蛋白質(zhì)的合成無(wú)關(guān)，科學(xué)家們認(rèn)為這大多數(shù)的DNA 應(yīng)該也有重要功能，只是我們還不知道。CRISPR-Cas9 技術(shù)提供了一個(gè)方法來(lái)探討此一問(wèn)題。利用此技術(shù)，科學(xué)家們可以針對(duì)特定序列，例如做為増強(qiáng)子(enhancer) 或轉(zhuǎn)錄出非轉(zhuǎn)譯型 RNA 的 DNA 序列去做研究。Farnham 和她的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，塬本以為和前列腺癌和大腸癌有關(guān)的突變加強(qiáng)子，經(jīng)由CRISPR-Cas9 刪除后，并不影響旁邊基因的表現(xiàn)，顯示我們塬本用來(lái)分析加強(qiáng)子強(qiáng)度的方法，并不能反映出真實(shí)狀況。由遺傳學(xué)家David Gifford 和Richard Sherwood 領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在四萬(wàn)鹼基對(duì)長(zhǎng)的 DNA 序列做一系列的突變，嘗試定出影響基因表現(xiàn)的 DNA 序列圖譜。不過(guò) CRISPR-Cas9 技術(shù)也不是萬(wàn)能的，在此方面的應(yīng)用有其侷限性，畢竟 Cas9 酵素只能由引導(dǎo) RNA 帶至特定區(qū)域，且在靠切割位置處 DNA序列必須有一定鹼基對(duì)序列共通性，當(dāng)進(jìn)行非轉(zhuǎn)譯型 DNA的研究時(shí)，不能在DNA任何位置任意切割，因?yàn)榭赡軙?huì)產(chǎn)生各種非預(yù)期的影響。最近張鋒所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)找到另一群 Cpf1 酵素群，其作用和 Cas9 酵素類似，但是可辨識(shí)不一樣的DNA序列，或許未來(lái)可以發(fā)現(xiàn)各種不同酵素，用來(lái)切割所有想要研究的基因體位置。
(四)CRISPR 以光來(lái)控制基因表現(xiàn) (CRISPR SEES THE LIGHT)
Gersbach的實(shí)驗(yàn)室使用基因編輯技術(shù)來(lái)探討細(xì)胞命運(yùn)以及其調(diào)控，他們希望能在培養(yǎng)皿里培養(yǎng)組織，用來(lái)篩檢藥物，并測(cè)試細(xì)胞治療成效。但是 CRISPR-Cas9 的作用結(jié)果是永久性的，與他們需要能夠暫時(shí)打開(kāi)或關(guān)掉基因表現(xiàn)的期待不合。于是他們加了一個(gè)能被藍(lán)光活化的蛋白質(zhì)到失去切割能力的 Cas9 酵素上：當(dāng)他們用藍(lán)光照射細(xì)胞，特定基因開(kāi)始表現(xiàn)，關(guān)掉藍(lán)光特定基因則停止表現(xiàn)。其他團(tuán)隊(duì)也有發(fā)展出類似的技術(shù)，改以化學(xué)物質(zhì)當(dāng)作基因表現(xiàn)的開(kāi)關(guān)。
(五)以CRISPR來(lái)制造各種生物模型(MODEL CRISPR)
以塬有的技術(shù)要制造出基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物來(lái)作為研究模型是非常耗時(shí)耗費(fèi)的工程，CRISPR-Cas9 將這以年為單位的過(guò)程大幅縮短為一個(gè)月內(nèi)可完成的實(shí)驗(yàn)。所以許多之前無(wú)法做到的研究，如今都有可能達(dá)成，例如從癌癥到神經(jīng)煺化研究，都已采用此一新技術(shù)。
一般而言，研究單位會(huì)將他們新發(fā)展出來(lái)的分子工具(Techniques of molecular biology)(注2)或新質(zhì)體(Plasmid)寄存于非營(yíng)利事業(yè)的Addgene 公司，以提供其他有興趣的科學(xué)家使用。自從2013年初研究人員首度發(fā)表他們能以 CRISPR-Cas9 技術(shù)切割人類細(xì)胞內(nèi)基因體任何一特定位置后，Addgene 公司的詢問(wèn)電話就沒(méi)停過(guò)，分子生物學(xué)家們都急于獲得此技術(shù)，能夠簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地修改編輯幾乎所有生物體的基因體。
目前真正革命性的發(fā)展正在實(shí)驗(yàn)室里展開(kāi)，CRISPR 提供生物學(xué)家所需要的一大特點(diǎn)：特定明確性，可以準(zhǔn)確地辨識(shí)龐大的基因體裹特 定的序列。而編輯DNA 只是其中一項(xiàng)技能，科學(xué)家進(jìn)一步將此技術(shù)做不同的改變，可以將蛋白質(zhì)送至特定基因體位置作調(diào)控，以啟動(dòng)或停止特定基因表現(xiàn)，甚至可以設(shè)計(jì)整個(gè)生物循環(huán)，最終了解細(xì)胞內(nèi)的系統(tǒng)和疾病的細(xì)節(jié)。 畢竟CRISPR-Cas9 只是一項(xiàng)技術(shù)，我們現(xiàn)在擁有此一強(qiáng)大的工具，最終仍需回歸解決生物問(wèn)題本身，那才是我們的真正目的。
注1：更改 DNA 序列，重新做出突變的蛋白質(zhì)。
注2：研究分子生物學(xué)所使用的工具或技術(shù)，例如分子純化繁殖(Molecular cloning)、聚合酶連鎖反應(yīng)(Polymerase chain reaction (PCR))、凝膠電泳Gel electrophoresis、南方[氏]印漬術(shù)Southern blotting等等。
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