十年前，當(dāng)研究人員開(kāi)始解析細(xì)菌和古細(xì)菌中一個(gè)稱為 CRISPR 結(jié)構(gòu)的時(shí)候，他們并沒(méi)有預(yù)料到這會(huì)給基因編輯世界帶來(lái)一場(chǎng)風(fēng)暴。在過(guò)去的這一年半時(shí)間里，CRISPR 方法已迅速席卷了整個(gè)動(dòng)物王國(guó)，成為 DNA 突變和編輯的一種“馬上”技術(shù)——迄今為止在幾乎每種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞類型中都能起作用，包括人類細(xì)胞，小鼠，斑馬魚(yú)和果蠅細(xì)胞；這種技術(shù)也易于操作，已經(jīng)有兩個(gè)研究組利用 CRISPR 分析了人類細(xì)胞中幾乎每個(gè)基因單突變（詳細(xì)報(bào)道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細(xì)胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項(xiàng)壯舉此前曾在小鼠中實(shí)現(xiàn)過(guò)，但未在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中完成過(guò)（詳細(xì)報(bào)道 Cell：中國(guó)科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一種防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌細(xì)胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點(diǎn)能表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當(dāng)微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過(guò)互補(bǔ)序列結(jié)合病毒基因組，并表達(dá) CRISPR 相關(guān)酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)用于其它非細(xì)菌細(xì)胞需要滿足兩個(gè)條件：一個(gè) Cas 酶，用于切斷靶標(biāo) DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個(gè)就是稱為導(dǎo)向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。gRNA 也就是細(xì)菌細(xì)胞中 CRISPR RNA 的一個(gè)更短的版本，它能與 Cas 形成復(fù)合物，指導(dǎo) Cas 到達(dá)正確的剪切位點(diǎn)。不過(guò)研究人員也可以通過(guò)結(jié)合其它元件，或者改變 Cas 活性，來(lái)調(diào)整這種工具在基因校正和基因調(diào)控方面的作用。
“目前，非傳統(tǒng)基因編輯應(yīng)用方面的生物學(xué)家利用一種新工具，分析細(xì)胞中，和整個(gè)生物機(jī)體中突變的作用”，來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細(xì)菌細(xì)胞中 CRISPR 的作用機(jī)制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過(guò)小鼠受精卵基因編輯構(gòu)建了敲除小鼠。
不過(guò) CRISPR 技術(shù)也存在一個(gè)主要的缺點(diǎn)，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結(jié)合的 DNA 只是部分與 gRNA 互補(bǔ)。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@兩者需要識(shí)別更長(zhǎng)的靶標(biāo) DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細(xì)胞表達(dá)方面要比 gRNAs 難得多，而且研究人員通常還需要驗(yàn)證十幾個(gè)不同的 TALENS，以及幾十個(gè)不同的 ZFNs，來(lái)證明其中一個(gè)有效。
近期《科學(xué)家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過(guò)程中 Cas 和 gRNA 的處理過(guò)程及解決方案，用于幫助新接觸這一技術(shù)的研究人員熟悉這項(xiàng)熱門技術(shù)。
如何 CRISPR 我的靶標(biāo)？
由于 CRISPR 系統(tǒng)并不復(fù)雜，因此我們所要做的就是將帶有質(zhì)粒（能表達(dá) Cas 和 gRNA）的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。研究人員可以采用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來(lái)自于一種鏈球菌，由 RNA 進(jìn)行指引，能無(wú)需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結(jié)合的 DNA 鏈，也能切斷其互補(bǔ)鏈。目前可以從 Addgene 購(gòu)買 Cas9 質(zhì)粒（65 美元），將其直接轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
gRNA 的長(zhǎng)度約為 80 個(gè)核苷酸，包含兩個(gè)區(qū)域： gRNA 5' 端前 20 個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)于靶標(biāo) DNA，能結(jié)合在靶標(biāo) DNA 上，剩余的約 60 個(gè)核苷酸（gRNA 長(zhǎng)度取決于表達(dá) gRNA 的質(zhì)粒）形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)能幫助 gRNA 與 Cas9 結(jié)合，并由此指導(dǎo)與 DNA 的結(jié)合。
gRNA 與 Cas9 一樣，也是通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)的，從 Addgene 可以購(gòu)買幾種這種質(zhì)粒（65 美元），但是與 Cas9 不同的是，我們需要自己定制與靶標(biāo)相匹配的表達(dá)質(zhì)粒。我們可以設(shè)計(jì)一個(gè)編碼 20 個(gè)堿基，與靶標(biāo) DNA 結(jié)合的片段，將其克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒里（編碼 gRNA 其它部分的60個(gè)核苷酸已經(jīng)在質(zhì)粒中了）。唯一的設(shè)計(jì)要求就是，gRNA 上要有一個(gè)片段，能與由任意核苷酸序列（N）+5' 末端兩個(gè)胞嘧啶核苷酸（-NCC）的 DNA 結(jié)合。這是因?yàn)?gRNAs 似乎與相對(duì)鏈包含兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤殘基（-NGG）的 DNA 片段結(jié)合最好，這種-NGG序列也就是 PAM 結(jié)構(gòu)（protospacer adjacent motif）。
要在靶標(biāo) DNA 區(qū)域中挑選合適的 20 個(gè)堿基對(duì)，有幾個(gè)方案可以選擇，比如麻省理工學(xué)院的 CRISPR Design（crispr.mit.edu）；德國(guó)癌癥研究中心開(kāi)發(fā)的E-Crisp （www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；還有 ZiFiTtargeter（zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu）。另外也可以篩選整個(gè)基因組，找到與你的靶標(biāo)位點(diǎn)相似的其它位點(diǎn)。
其中只有 CRISPR Design 和 E-Crisp 可以預(yù)測(cè)哪些 gRNA 序列特異性最強(qiáng)，ZiFiT 不具有這種功能。但是由于這些預(yù)測(cè)位點(diǎn)周邊的不確定性，研究人員仍然無(wú)法確保 gRNA 的嚴(yán)格特異性，因此專家們通常建議檢測(cè)至少 3-5 個(gè)不同的 gRNA。這些序列可以通過(guò)例如 Sigma Aldrich 公司，或者 Integrated DNA Technologies 公司合成，每個(gè)費(fèi)用大約為 10-20 美元。
雖然 Cas9 和 gRNA 能通過(guò)各自的質(zhì)粒來(lái)表達(dá)，但是研究人員也可以選擇在同一個(gè)質(zhì)粒中表達(dá) gRNA 和 Cas9，這對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)說(shuō)比較合適，比如免疫細(xì)胞。Addgene 公司也提供這種雙表達(dá)質(zhì)粒（價(jià)格為 65 美元）。不過(guò)為了快速地測(cè)試不同的gRNAs，研究人員可以利用 PCR 構(gòu)建編碼 gRNA 的 DNA 片段，其中包含激活表達(dá)的啟動(dòng)子，然后將這個(gè)片段與攜帶 Cas9 的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這種方法無(wú)需克隆 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒，可以節(jié)約兩天時(shí)間，來(lái)自Broad研究院的張鋒表示。
一旦你已經(jīng)在細(xì)胞中表達(dá)了 gRNA 和 Cas9 酶，那么這一復(fù)合物就能完成余下的工作，輕而易舉地切斷靶標(biāo) DNA 的兩條鏈。盡管細(xì)胞的 DNA 修復(fù)機(jī)制會(huì)試圖修補(bǔ)片段，但是由于存在一個(gè)稱為非同源末端連接（nonhomologous end joining）的過(guò)程，因此往往最終會(huì)刪除或添加一個(gè)或兩個(gè)核苷酸，造成移碼突變，阻止基因表達(dá)。這樣通過(guò)靶向基因起始位點(diǎn)的周圍區(qū)域，研究人員就能阻斷幾乎所有的表達(dá)。
如何檢測(cè)基因編輯的效率？
雖然 Cas9-gRNA 復(fù)合物作用強(qiáng)大，但是我們可能仍然希望能直接檢測(cè)下這一工具是否正確突變了靶標(biāo)，或者有沒(méi)有出現(xiàn)脫靶的現(xiàn)象。這種方法與 ZFN 、TALEN不同——后兩者通常需要檢測(cè)許多融合蛋白，從中找到編輯靶標(biāo)位點(diǎn)的那一個(gè)，CRISPR 方法則往往是利用嘗試的第一個(gè) gRNA 突變靶標(biāo)，正如來(lái)自麻省總醫(yī)院的病理學(xué)家 Keith Joung 說(shuō)的那樣，他的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的約 90% 的 gRNAs 都完成了目的靶標(biāo)的突變。
然而，Cas9-gRNA 在避免脫靶方面并不是那么可靠，去年發(fā)表的少數(shù)研究表明，一些 gRNAs 出現(xiàn)了多達(dá) 5 次錯(cuò)配的脫靶問(wèn)題。不過(guò)還有一些研究表明 gRNAs 的特異性也很強(qiáng)，未曾出現(xiàn)過(guò)一次脫靶。Joung 表示，雖然沒(méi)有又快又好的方法來(lái)提高特異性，但我們可以挑選與潛在可能脫靶區(qū)域相似性最小的 gRNAs，來(lái)進(jìn)行這項(xiàng)研究，CRISPR Design等程序可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
Cas9-gRNA 工具常用于失活許多細(xì)胞中的一個(gè)興趣基因。研究人員可以通過(guò)證明這個(gè)基因產(chǎn)物無(wú)法表達(dá)，或者由于基因產(chǎn)物缺失而出現(xiàn)的某種細(xì)胞表型，來(lái)驗(yàn)證這個(gè)工具的作用。為了確保這些作用不是由于突變了脫靶位點(diǎn)造成的，我們可以利用一種 Surveyor assay 來(lái)直接分析 DNA 靶標(biāo)位點(diǎn)，預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)。這需要通過(guò) PCR，以及一種特殊的酶（只切割帶有突變的 PCR 產(chǎn)物）放大靶標(biāo)位點(diǎn)，然后再將突變和未突變的 DNA 片段在瓊脂糖凝膠中分離開(kāi)來(lái)，突變的片段會(huì)小一些，因?yàn)樗鼈儽磺袛噙^(guò)。
這種方法也可以用于構(gòu)建具有所有興趣基因相同突變的克隆細(xì)胞系，或者來(lái)自敲除小鼠的小鼠細(xì)胞，為了完成這些任務(wù)，我們可能需要確保 Cas9-gRNA 復(fù)合物沒(méi)有在未預(yù)測(cè)位點(diǎn)上引入一個(gè)突變。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)我們可能還需要進(jìn)行整個(gè)基因組的高通量測(cè)序。
如何優(yōu)化 gRNA 的特異性？
除了挑選與非靶標(biāo)位點(diǎn)互補(bǔ)性最小的 gRNA 序列以外，還有兩種可以減少脫靶效應(yīng)的方法。
一個(gè)是轉(zhuǎn)染的 Cas9 和 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒（或者 gRNA PCR 盒）數(shù)量盡可能的少，只要滿足所必需的靶活性的最低量就行。因?yàn)檫@些濃度足以令靶標(biāo)位點(diǎn)突變，就不會(huì)去突變非特異性位點(diǎn)，——脫靶活性通常比靶向活性要低。
另一種策略是采用 Cas9 的另外一種突變版本： Cas9 nickase，這種酶只會(huì)切割結(jié)合 gRNA 的那條 DNA 單鏈。正常的 Cas9 切割的是雙鏈，單鏈缺口通常細(xì)胞會(huì)修補(bǔ)，但是如果細(xì)胞中表達(dá)的是 Cas9 nickase，以及與同一 DNA 靶標(biāo)結(jié)合的一對(duì) gRNAs，那么缺口上就能會(huì)出現(xiàn)突變。這種方法可以降低脫靶活性，因?yàn)椴惶赡軆蓚€(gè) gRNAs 同時(shí)恰巧靠近脫靶位點(diǎn)。不過(guò)這種方法打靶效率可能會(huì)比正常 Cas9 和單個(gè) gRNA 低。
要想消除所有的脫靶效應(yīng)是不可能的，因?yàn)槠渲性S多可能出現(xiàn)在基因組中的任何非編碼區(qū)域。不過(guò)我們可以認(rèn)為靶基因失活能引起可見(jiàn)的細(xì)胞效應(yīng)，如果幾個(gè)結(jié)合不同基因區(qū)域的 gRNAs 出現(xiàn)了相同的表型，那么就能假定具有不同的脫靶效應(yīng)，Joung 說(shuō)。通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒將基因引入細(xì)胞，恢復(fù)失活基因的表型也是一種不錯(cuò)的驗(yàn)證方法。
利用 Cas9-gRNA 系統(tǒng)還能做什么？
過(guò)去一年半的研究表明，Cas9-gRNA 系統(tǒng)可以用于多個(gè)方面，比如張鋒實(shí)驗(yàn)室就利用這一系統(tǒng)，在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)了，來(lái)自不同表達(dá)質(zhì)粒的5個(gè)靶向不同基因的 gRNAs，以及來(lái)自一個(gè)獨(dú)立表達(dá)質(zhì)粒的 Cas9，切割所有靶標(biāo)位點(diǎn)?！鞍邢虺^(guò)5個(gè)基因也是可能的”，張鋒說(shuō)。而要想利用 ZFN 和 TALENS 系統(tǒng)做到這一點(diǎn)，是不可想象的，因?yàn)榘邢騿为?dú)一個(gè)位點(diǎn)都要花費(fèi)大量的人力物力。
除了失活基因，利用 Cas9-gRNA 還可以糾正基因。來(lái)自佐治亞理工學(xué)院的生物醫(yī)學(xué)工程叫聲包鋼（Gang Bao，音譯）正在朝著這方面努力，他嘗試糾正一個(gè)破壞性的單核苷酸突變，患有鐮刀狀細(xì)胞貧血癥的患者其 β-珠蛋白基因上的兩個(gè)拷貝就出現(xiàn)了這種突變。研究人員利用 Cas9 nickase 和一對(duì) gRNA 造成雙缺口，同時(shí)將一個(gè)線性 DNA 片段轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，片段大小通常為 400-800 堿基，也可以是能作為基因糾正模板的小質(zhì)粒。
另外一個(gè)方面就是利用 Cas9 突變，這個(gè)突變并沒(méi)有完全切割 DNA，而是與能開(kāi)啟或關(guān)閉基因表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)域融合。gRNA 可以指導(dǎo)這個(gè)修改后的 Cas9 到達(dá)正確的遺傳元件，比如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，激活或抑制表達(dá)。這種用于基因抑制的方法被稱為 CRISPRi，CRISPRi 已被證明比 RNAi（RNA 干擾）更為有效。
注：本文標(biāo)注的費(fèi)用均為美國(guó)當(dāng)?shù)貎r(jià)格，僅供參考。
