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?            CRISPR-Cas9大全：基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入 2015-10-15 CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用技術(shù) CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景 1. CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介 1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史 1987 年，日本課題組在K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002 年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 2005 年發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò)CRISPR 系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。 2007 年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR 系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008 年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR 系統(tǒng)的功能 2013 年初，MIT 的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)人293T 細(xì)胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 細(xì)胞Th 基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 細(xì)胞和K652 細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA 修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。 1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu) CRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括: 由不連續(xù)的重復(fù)序列R( repeat) 與長(zhǎng)度相似的間區(qū)序列S( spacers) 間隔排列而成的CRISPR 簇，前導(dǎo)序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相關(guān)蛋白基因cas。 Cas蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理 CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得 首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源 DNA 潛在的 PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理 CRIPSR 基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工) 當(dāng)該噬菌體再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR 簇首先轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。 CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾 crRNA 結(jié)合相關(guān)的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas 蛋白對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行斷裂和降解。 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理 2、CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用 2.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù) 基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。 這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。 通過(guò)修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因 基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn) 2.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù) CRISPRs技術(shù)是一種由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。 Mali 等人 利用來(lái)自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR 相關(guān)蛋白Cas9，在一段人為重組的sgRNA( small-guide RNA) 的引導(dǎo)下，針對(duì)小鼠和人類基因組的特定基因片段實(shí)現(xiàn)了精確的剪切。這種通過(guò)可編程RNA 進(jìn)行DNA 改造的技術(shù)為基因組編輯開(kāi)創(chuàng)了一條新的途徑。 例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列。 2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。 3、轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證。 4、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 5、敲除效果檢測(cè)。 6、建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株 2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活 在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白失去對(duì)ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ 結(jié)合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為Dead Ｃas9。