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作者：中國(guó)科普博覽文字取材于科普中國(guó)作品《“基因敲除狗”是怎么造出來(lái)的？》

美國(guó)天普大學(xué)華人科學(xué)家胡文輝等人近日?qǐng)?bào)告說(shuō)，他們利用基因編輯技術(shù)，有效剔除了一種人源化小鼠多個(gè)器官組織中的人類(lèi)艾滋病病毒，朝著開(kāi)展人類(lèi)臨床試驗(yàn)的方向邁出一大步。

這次所用的基因編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9技術(shù)，顧名思義，這項(xiàng)技術(shù)能夠讓人類(lèi)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。自CRISPR/Cas9技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。與前兩代技術(shù)相比，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。

CRISPR/Cas9技術(shù)的靈感來(lái)源于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。與哺乳動(dòng)物的二次免疫應(yīng)答類(lèi)似，細(xì)菌在抵抗病毒或外源質(zhì)粒入侵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”，來(lái)抵抗該種外源遺傳物質(zhì)的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

那么CRISPR/Cas9技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要什么那些條件呢？

首先，在CRISPR/Cas9技術(shù)中，我們把即將被編輯的細(xì)胞基因組DNA看作病毒或外源DNA?；蚓庉嫷膶?shí)現(xiàn)只需要兩個(gè)工具——向?qū)NA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

其中，向?qū)NA的設(shè)計(jì)并不是隨機(jī)的，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（即三堿基序列NGG，其中N可以是任意堿基），而且向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA(向?qū)NA1，向?qū)NA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

對(duì)于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。

圖1 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除掉部分基因原理圖（繪圖肖媛）

而DNA片斷的插入或定點(diǎn)突變的實(shí)現(xiàn)，只需在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞提供一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒，這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過(guò)程中引入片段插入或定點(diǎn)突變，對(duì)受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，并將其導(dǎo)入代孕母體中，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯動(dòng)物模型的構(gòu)建。

圖2 CRISPR/Cas9技術(shù)插入新基因原理圖（繪圖肖媛）

當(dāng)然，CRISPR/Cas9技術(shù)的成功率并非百分之百。向?qū)NA靶向序列的非特異性，以及DNA損傷修復(fù)的不確定性，都可能會(huì)導(dǎo)致基因組上其它位置產(chǎn)生未知的突變，也就是所謂的“脫靶”現(xiàn)象，這也是現(xiàn)階段影響CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的瓶頸之一。但隨著科研人員不斷對(duì)Cas9蛋白的優(yōu)化改造，對(duì)靶基因識(shí)別特異性的增強(qiáng)， CRISPR/Cas9技術(shù)的“打靶”效率將不斷提高。

CRISPR/Cas9技術(shù)在醫(yī)療健康、生產(chǎn)生活、家畜育種等領(lǐng)域的應(yīng)用，不斷取得喜人的新成果。

如在醫(yī)療健康領(lǐng)域，用iPS細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）治療人類(lèi)的鐮刀形貧血癥，可以將病人的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)同源重組來(lái)修復(fù)發(fā)生突變的血紅蛋白基因，再將修復(fù)的iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)。此外，像使用CRISPR技術(shù)根除HIV病毒、誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自我毀滅、構(gòu)建癌癥模型等最新成果先后被Nature等著名雜志所報(bào)道。在奶制品的發(fā)酵中，利用CRISPR/Cas9增強(qiáng)發(fā)酵菌株對(duì)噬菌體的防御能力；在家畜育種方面，也正在利用基因編輯工具通過(guò)對(duì)顯著影響家畜生產(chǎn)性能的基因位點(diǎn)進(jìn)行改良，以實(shí)現(xiàn)豬、牛、羊等大型家畜生產(chǎn)性能的提高等。

作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，CRISPR/Cas9的創(chuàng)新性、技術(shù)性毋庸置疑，隨著對(duì)CRISPR系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的加深，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化改造，相信其打靶效率會(huì)進(jìn)一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技術(shù)終究會(huì)帶來(lái)一場(chǎng)科學(xué)史上的巨大變革。