抗 體 應(yīng) 用
應(yīng)用詳情縮寫
免疫印跡法凝膠類型: 還原的, 天然的
裂解產(chǎn)物類型: 細(xì)胞裂解產(chǎn)物, 組織裂解產(chǎn)物, 免疫原過(guò)表達(dá)裂解產(chǎn)物WB
單細(xì)胞免疫印跡法（single cell Western）scWB
免疫組織化學(xué)固定: 丙酮, 乙醇, 福爾馬林/甲醛/多聚甲醛, 甲醇, 微波, 加熱
包埋: 丙烯酸/塑料, 見(jiàn)如下IH
包埋: 石蠟IHC-P
包埋: 冰凍IHC-F
自由漂浮切片法IHC-Free
免疫細(xì)胞化學(xué)
IC
鄰位連接技術(shù)PLA
in-cell WesternICW
流式細(xì)胞術(shù)
FC
細(xì)胞分選FACS
免疫沉淀
IP
染色質(zhì)免疫沉淀ChIP
染色質(zhì)免疫沉淀序列測(cè)定ChIP-Seq
RNA免疫沉淀RIP
交聯(lián)免疫沉淀CLIP
免疫測(cè)定
ELISAELISA
放射性免疫測(cè)定RIA
酶聯(lián)免疫測(cè)定EIA
免疫-PCRI-PCR
功能測(cè)定
激活A(yù)
封閉/中和Neut
電泳遷移實(shí)驗(yàn)
EMSA
質(zhì)譜
MS
抗肽抗體穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)和捕獲SISCAPA
免疫-MRMI-MRM
免疫-MALDIiMALDI
封閉/中和Neut
質(zhì)譜免疫分析MSIA
表一：抗體的主要應(yīng)用
抗體即是B淋巴細(xì)胞抗原受體的可溶性形式，專門由成熟的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。
抗體免疫球蛋白分子由2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同，可以把小鼠和人體內(nèi)的抗體分為五類亞型?？贵w分子的各個(gè)鏈之間以二硫鍵相連，從而使整個(gè)分子具有一定的靈活性。分子中沒(méi)有輕鏈的部分稱為可變區(qū)或Fc段（可結(jié)晶部分）;此區(qū)域是由一組固定的基因所決定，同一個(gè)種屬中的所有同亞型抗體此區(qū)域是一致的。分子中既有重鏈又有輕鏈的部分稱為恒定區(qū)或Fab段（抗原結(jié)合區(qū)）; 此區(qū)域的極端包含識(shí)別并結(jié)合靶抗原表位的高可變位點(diǎn)。Fab段也是由一組固定的基因決定，但需要進(jìn)一步的體細(xì)胞突變產(chǎn)生獨(dú)特的和高特異的可變位點(diǎn)（圖1）。
圖 1. 抗體的分子結(jié)構(gòu)
蛋白檢測(cè)和純化
免疫沉淀
免疫沉淀（IP），亦稱為“pull-down”實(shí)驗(yàn)，即抗體在細(xì)胞裂解液， 生物體液， 或其它溶液中標(biāo)記和沉淀（“pull-down”）分離出相應(yīng)的目標(biāo)抗原。通過(guò)在抗體的Fc段結(jié)合不同類別微珠（例如磁性珠，瓊脂糖，瓊脂糖凝膠），再用離心或其他機(jī)械方法把抗體抗原復(fù)合物從總蛋白中分離出來(lái)（圖2）。
圖 2. 標(biāo)準(zhǔn)免疫沉淀法的流程示意圖。
IP檢測(cè)在許多細(xì)胞和分子生物學(xué)研究很受歡迎。根據(jù)其最基本的原理，IP常用來(lái)純化目標(biāo)抗原以進(jìn)行后續(xù)研究。IP也常用于研究穩(wěn)態(tài)細(xì)胞或經(jīng)過(guò)特定處理的細(xì)胞中的各種蛋白質(zhì)之間的相互作用。在通過(guò)IP研究蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，其中一個(gè)已知蛋白的抗體將用于免疫沉淀步驟，隨后再可通過(guò)如免疫印跡法（見(jiàn)下文）來(lái)確定與這個(gè)已知蛋白結(jié)合并共同沉淀分離出來(lái)的另一種蛋白分子。
免疫吸附實(shí)驗(yàn)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用來(lái)對(duì)一個(gè)特定的可溶性蛋白分子進(jìn)行定性和定量分析，如血清， 或液體的樣品，如生物體液和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的特異性抗體或蛋白質(zhì)的有無(wú)及濃度。此方法是利用了聚苯乙烯檢測(cè)板吸附蛋白質(zhì)或抗體的能力及抗體特異性結(jié)合靶抗原的能力。一般來(lái)說(shuō)，此方法可通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品在一定波長(zhǎng)下的吸光度，再結(jié)合已知的抗原或抗體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出檢測(cè)樣品中此抗原或抗體的濃度。有3種常用的ELISA檢測(cè)方法。
直接ELISA法
直接酶聯(lián)試驗(yàn)使用不同量化的單克隆抗體來(lái)確定溶液中的某種特定抗原的濃度。
例如，直接ELISA可通過(guò)測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子含量從而確定此群細(xì)胞（經(jīng)刺激或抑制處理）分泌細(xì)胞因子的水平。
直接ELISA法常以“三明治”法進(jìn)行，即兩種單克隆抗體通過(guò)不同的抗原表位結(jié)合在同一個(gè)靶抗原上，把靶抗原夾在中間。首先把“捕獲”抗體包被在測(cè)定板上。然后在洗滌和封閉后，將待測(cè)溶液加入到測(cè)定孔中，讓“捕獲”抗體去捕獲溶液中存在的靶抗原。洗去樣品中其余的蛋白分子，在測(cè)定孔中加入偶聯(lián)生物素“檢測(cè)”抗體。再加入鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合酶，以結(jié)合偶聯(lián)生物素的檢測(cè)抗體。最后，在測(cè)定孔中加入酶的顯色底物?？梢愿鶕?jù)測(cè)定測(cè)定孔中的特定顏色變化進(jìn)行相對(duì)定量: 顏色變化的越多，樣品中的抗原濃度越高。可以通過(guò)已知靶抗原濃度的樣品測(cè)定孔制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對(duì)未知濃度的樣品測(cè)定孔進(jìn)行絕對(duì)定量。這個(gè)檢測(cè)過(guò)程不需要“捕獲抗體”也可以進(jìn)行；換句話說(shuō)，抗原可直接包被到檢測(cè)孔進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。但是，通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)靶抗原其特異性更高（圖3）。
圖 3. 標(biāo)準(zhǔn)直接夾心ELISA法的流程示意圖。
間接ELISA法
間接酶聯(lián)試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)溶液中的抗原特異性抗體的含量。
在此項(xiàng)檢測(cè)中，某種特定的抗原會(huì)直接包被到檢測(cè)板的樣品孔中。可能含有此種抗原特異性抗體的待檢樣品（如血清，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基）被加入到檢測(cè)孔，特異性抗體抗原會(huì)相互結(jié)合。接下來(lái)，在檢測(cè)孔加入可以結(jié)合抗體Fc段的酶聯(lián)第二抗體，讓它與已經(jīng)結(jié)合在特異性抗原上的抗體相結(jié)合。最后，再加入比色底物，底物被第二抗體上偶聯(lián)的酶酶解，通過(guò)吸光度的測(cè)定值反映所要檢測(cè)抗體的含量。
競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法
競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)試驗(yàn)通常用來(lái)檢測(cè)小抗原分子。
在此類檢測(cè)中，把未知濃度的靶抗原樣本加入到已包被了已知濃度的相同靶抗原的檢測(cè)孔中。然后加入檢測(cè)靶抗原的標(biāo)記抗體。然后洗去可溶性的抗原抗體復(fù)合物，結(jié)合在檢測(cè)孔中抗原上的抗體含量最后被檢測(cè)到。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法最后檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度一般與其他ELISA方法相反。
具體說(shuō)來(lái)，樣品中游離的抗原濃度越高，就會(huì)結(jié)合越多的抗體，因此結(jié)合到檢測(cè)板上固定抗原的抗體就會(huì)減少，因此最后檢測(cè)到的信號(hào)就會(huì)越弱（圖4）。
圖 4. 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法的流程示意圖。
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法
酶聯(lián)斑點(diǎn)類似于夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子或其他可溶性因子，是通過(guò)結(jié)合在檢測(cè)板上的單克隆抗體來(lái)捕獲把抗原，以及可以用于進(jìn)行比色測(cè)定的酶聯(lián)第二單克隆抗體檢測(cè)捕獲的靶抗原。但是不同的是，在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)中，產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞可直接培養(yǎng)在預(yù)先包被了捕獲抗體和封閉過(guò)的檢測(cè)板中，此檢測(cè)可以從一個(gè)斑點(diǎn)中捕獲單個(gè)細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子。培養(yǎng)特定的一段后，棄去檢測(cè)板中的細(xì)胞。其余后續(xù)的檢測(cè)步驟同普通ELISA法非常類似。只是最后一步不是通過(guò)檢測(cè)某波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)分析，而在顯微鏡直接進(jìn)行視覺(jué)觀察或使用專門的讀板器。成功檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞因子細(xì)胞的ELISPOT法在每個(gè)檢測(cè)孔中會(huì)出現(xiàn)很多顏色深淺不一的斑點(diǎn)，每個(gè)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)單細(xì)胞。ELISPOT法特別適用于檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量非常少的細(xì)胞群， 比如檢測(cè)免疫小鼠的抗原特異性T細(xì)胞，此類數(shù)量非常少的細(xì)胞群用其他的方法一般很難檢測(cè)到（圖5）。
圖 5. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法。
A, 流程示意圖。 B, 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)的代表性結(jié)果圖。
免疫吸附技術(shù)可與微陣列技術(shù)結(jié)合使用，從而實(shí)現(xiàn)高通量功能蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定。在此類檢測(cè)中，預(yù)先在玻璃或聚苯乙烯載玻片上包被捕獲抗體或樣品（如細(xì)胞裂解產(chǎn)物）。前者（包被捕獲抗體）類似的經(jīng)典的夾心ELISA、ELISPOT，因?yàn)榘锌乖Y(jié)合在固定抗體和游離抗體之間，后者（直接包被樣品）類似于直接ELISA法，因?yàn)榘锌乖苯咏Y(jié)合在載玻片上。這兩種實(shí)驗(yàn)方法中的檢測(cè)抗體都是針對(duì)于各種已知抗原的熒光標(biāo)記抗體。該技術(shù)可快速篩選出表達(dá)或活化發(fā)生變化的蛋白質(zhì)。
免疫PCR
免疫PCR（I-PCR）結(jié)合了PCR核酸擴(kuò)增的靈敏度，和基于抗體測(cè)定法的特異性，因此這項(xiàng)技術(shù)增加了檢測(cè)靈敏度。通常情況下，可以在不同的應(yīng)用中獲得比ELISA方法的檢測(cè)極限100-10000倍擴(kuò)增。 Ⅰ-PCR最先在1992年由佐野等人所述。盡管該技術(shù)有潛力，幾年來(lái)在診斷和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中I-PCR方法的用途被一些問(wèn)題所限制，包括測(cè)試的持續(xù)時(shí)間，由此導(dǎo)致的錯(cuò)誤率的增加。另外，主要的缺點(diǎn)之一是抗體難以與寡核苷酸結(jié)合。幾種解決方案已經(jīng)提出，如快速，高效的結(jié)合方法（如Innova Biosciences公司的Thunder-Link?抗體-寡核苷酸結(jié)合系統(tǒng)）。此外，多重和高通量技術(shù)的引入大大改善了I-PCR方法，這目前已用作一些細(xì)菌和病毒病原體的常規(guī)診斷測(cè)試，并用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物和食品污染。定量PCR與I-PCR相結(jié)合（QI-PCR），可以定量復(fù)雜生物樣品中的低豐度生物標(biāo)記物，這難以通過(guò)傳統(tǒng)的免疫方法定量。
蛋白印跡
免疫印跡法
蛋白質(zhì)印跡是一種通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并通過(guò)電轉(zhuǎn)移把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到吸附膜上。一經(jīng)蛋白印跡后，即可通過(guò)特異性的標(biāo)記抗體檢測(cè)到相應(yīng)蛋白質(zhì)。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可用以檢測(cè)已被SDS化學(xué)變性的蛋白。然而，某些特定的抗體不會(huì)再一個(gè)變性的蛋白質(zhì)分子上識(shí)別其抗原表位，因此需要進(jìn)行不含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
蛋白印跡可以通過(guò)濕法， 半干法， 或干法進(jìn)行。在濕法，凝膠夾在印跡膜和各種過(guò)濾裝置中間，然后把整個(gè)裝置埋進(jìn)一個(gè)裝滿三甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖的電極槽中。在半干法，夾在中間的凝膠周圍只有少量的緩沖，然后封閉在電極板之間。最后，在干式系統(tǒng)中不需要緩沖液，使用帶有電極，緩沖液和膜的預(yù)組裝即用的裝置。 雖然干法轉(zhuǎn)膜較快，但需要很好地?cái)M合各部分的夾層配件，而濕法轉(zhuǎn)膜很少會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，可以盡量保持重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。此外，如果半干法轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，較小分子量的蛋白質(zhì)可能會(huì)從膜上轉(zhuǎn)過(guò)。
轉(zhuǎn)膜后，需對(duì)膜進(jìn)行封閉，以減少非特異性蛋白結(jié)合，然后進(jìn)行用一抗孵育膜，以研究感興趣的目標(biāo)蛋白。單克隆抗體通常具有更高的特異性；然而許多單克隆抗體產(chǎn)生于某個(gè)特定肽段而不是一個(gè)天然蛋白質(zhì)，因此可能無(wú)法檢測(cè)到PAGE所分離的天然蛋白。也可使用多克隆抗體，但易形成較高的背景值。因一抗通常無(wú)標(biāo)記，所以需要一個(gè)可以結(jié)合在一抗Fc段的標(biāo)記的二抗，以用于最后的檢測(cè)。通常會(huì)用酶來(lái)標(biāo)記二抗。酶標(biāo)記后的印跡可通過(guò)化學(xué)發(fā)光酶底物及放射自顯影技術(shù)成像。被抗體檢測(cè)和標(biāo)記到的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)在圖像的暗區(qū)。
圖 6. 免疫印跡法。
A, 流程示意圖。 B, 代表性結(jié)果圖。
斑點(diǎn)印跡法
點(diǎn)印跡類似于免疫印跡法，在膜上檢測(cè)目標(biāo)蛋白；但是斑點(diǎn)印跡法中檢測(cè)的蛋白質(zhì)不用電泳進(jìn)行分離。取而代之的是，含有目標(biāo)蛋白的樣品被直接“點(diǎn)”到膜上。這不是一種定量的方法，但它可以直接檢測(cè)某種特定蛋白的有無(wú); 例如，斑點(diǎn)印跡法可用于檢測(cè)蔗糖梯度分離的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的某些蛋白質(zhì)定位。
檢測(cè)蛋白質(zhì)-核酸分子間的相互作用
染色質(zhì)免疫沉淀
染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）最初是在20世紀(jì)80年代研究RNA聚合酶II與靶基因相互作用的過(guò)程中發(fā)展起來(lái)的。在此過(guò)程中，細(xì)胞被固定在甲醛或類似的固定劑中以使細(xì)胞DNA和相關(guān)蛋白分子發(fā)生交聯(lián)。固定的細(xì)胞隨后經(jīng)超聲處理，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物斷裂為100-300 bp的片段，然后用結(jié)合在DNA上的特異性蛋白（如組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子）的抗體，按照標(biāo)準(zhǔn)方法免疫沉淀相關(guān)的DNA片段。最后，通過(guò)去交聯(lián)分離DNA-蛋白復(fù)合物，再行PCR分析結(jié)合在蛋白上的DNA片段。同時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA一起共沉淀，可以通過(guò)質(zhì)譜法為基礎(chǔ)的方法來(lái)識(shí)別。理想情況下，標(biāo)準(zhǔn)的CHIP法是用來(lái)驗(yàn)證某個(gè)蛋白和某個(gè)假定的靶基因之間的相互作用，因?yàn)橐鶕?jù)假定的靶基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物（圖7）。
圖 7. 染色質(zhì)免疫沉淀的流程示意圖。
CHIP法有個(gè)局限性，即交聯(lián)步驟可能會(huì)破壞蛋白分子結(jié)構(gòu)，從而阻礙抗體與其結(jié)合，影響后續(xù)的免疫沉淀。此時(shí)，可以嘗試無(wú)交聯(lián)步驟的CHIP法；此過(guò)程稱為N-ChIP的免疫沉淀法。盡管去交聯(lián)提高抗原識(shí)別能力，但是一般只適用于目標(biāo)蛋白強(qiáng)烈地結(jié)合在DNA上這種情況。
ChIP-on-Chip
最近，芯片被改良以用于高通量分析。例如，ChIP-on-Chip結(jié)合了CHIP法和微陣列技術(shù)，適用于熒光標(biāo)記序列的全基因組篩選。在這些檢測(cè)中，用不同的熒光染料標(biāo)記沉淀組DNA和對(duì)照組DNA（通常不經(jīng)沉淀的總輸入），然后用各組DNA與DNA微陣列芯片甚至整個(gè)基因組小寡核苷酸進(jìn)行雜交。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化分析技術(shù)，可以從芯片獲得CHIP樣品相對(duì)于DNA對(duì)照組的DNA結(jié)合位點(diǎn)的詳細(xì)信息。
染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序
將染色質(zhì)沉淀技術(shù)與現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，從而有利于鑒定前所未知的靶基因序列。由于高通量測(cè)序可以鑒定和提供大量的基因組信息，因此染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序適用于整個(gè)基因組的染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)。這個(gè)方法是一個(gè)非常強(qiáng)大的工具，可以鑒定全基因組DNA與蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而揭示生物過(guò)程和基因調(diào)控。近日，一個(gè)以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的稱為內(nèi)源性蛋白快速免疫質(zhì)譜的方法（RIME）被提議與Chip-seq相結(jié)合。這種組合方法提供了目標(biāo)蛋白的順?lè)唇M和相互作用組兩種信息。
交聯(lián)免疫沉淀
交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）是首先由郵樂(lè)等人在2003年開(kāi)發(fā)的方法。他們研究剪接因子NOVA和神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白（RBP）之間的相互作用。類似于染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)用來(lái)分析DNA-蛋白質(zhì)的相互作用，交聯(lián)免疫沉淀技術(shù)可用于分析RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序的方法的類似于染色質(zhì)免疫沉淀；然而，因?yàn)槟繕?biāo)核酸不同，因此也存在幾個(gè)明顯的差異。在染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序中，推薦使用的交聯(lián)劑是紫外線照射。由于轉(zhuǎn)錄組RNA一般較短，所以不需要經(jīng)過(guò)超聲處理，細(xì)胞可以在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中裂解。但是必須在所有的裂解產(chǎn)物中添加RNase抑制劑以防止目標(biāo)RNA的降解。CLIP可以分析RNA-蛋白質(zhì)相互作用，繪制全基因組規(guī)模的RNA結(jié)合位點(diǎn)。 尤其是HITS-CLIP已廣泛用于繪制幾個(gè)剪接因子，如PTB，F(xiàn)OX2，以及Argonaute蛋白質(zhì)-RNA相互作用位點(diǎn)。然而，HITS-CLIP顯現(xiàn)了與交聯(lián)效率和RBP結(jié)合位點(diǎn)的精確測(cè)定相關(guān)的一些缺點(diǎn)。為了克服這些問(wèn)題，在2010年哈夫納等人開(kāi)發(fā)了光活化 - 核糖核苷增強(qiáng)交聯(lián)和免疫沉淀（PAR-CLIP），在2011年柯尼希等提出了個(gè)別核苷酸方案CLIP（iCLIP），提供了RBP結(jié)合位點(diǎn)在單核苷酸水平的 解決方案。
RNA免疫沉淀
RNA免疫沉淀（RIP）是類似ChiP的方法，定性蛋白質(zhì)和特定的RNA序列之間的相互作用。主要步驟包括：i）在活細(xì)胞加入甲醛形成可逆的蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián); ⅱ）通過(guò)使用特異性抗體免疫沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì); ⅲ）交聯(lián)的逆轉(zhuǎn); ⅳ）回收和用RT-PCR分析相關(guān)的RNA。
電泳遷移實(shí)驗(yàn)
電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSAs）是用來(lái)研究DNA結(jié)合蛋白對(duì)特定DNA位點(diǎn)的親和力。在經(jīng)典的EMSAs中，含有結(jié)合位點(diǎn)的放射性標(biāo)記的DNA片段與目標(biāo)蛋白共同孵育。結(jié)合的親和力是根據(jù)凝膠電泳中DNA向上遷移的速度來(lái)確定，由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA，分子量發(fā)生了增加，從而導(dǎo)致在凝膠電泳中的遷移變緩慢。為了提高檢測(cè)的特異性，可以在反應(yīng)體系中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體；如果抗體和目標(biāo)蛋白結(jié)合，進(jìn)一步減慢DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移速度，超級(jí)電泳遷移實(shí)驗(yàn)。
原位檢測(cè)技術(shù)
免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）是常用來(lái)在原位檢測(cè)組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和定位的兩種方法。兩種方法主要在樣品制備上有所不同；IHC是在固定的整個(gè)組織切片上進(jìn)行，而ICC是在從基質(zhì)中分離出來(lái)的細(xì)胞中進(jìn)行（例如，血液細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞離心涂片法，培養(yǎng)的細(xì)胞可在玻片上的長(zhǎng)成單細(xì)胞層）（圖8）。
圖 8. 免疫組織化學(xué)技術(shù)的流程示意圖及代表性結(jié)果圖。用抗體標(biāo)記小鼠肌間神經(jīng)節(jié)，并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像。綠色，酪氨酸羥化酶標(biāo)記。藍(lán)色，自發(fā)熒光。
固定方法
用于IHC或ICC技術(shù)的有幾種常見(jiàn)的組織或細(xì)胞固定方法，固定方法的選擇取決于檢測(cè)分析的類型。用免疫組織化學(xué)檢測(cè)的完整組織樣本固定通常用甲醛，這是一種半可逆交聯(lián)劑，來(lái)源于多聚甲醛，也可進(jìn)一步稀釋為福爾馬林。雖有研究指出，在甲醛中過(guò)分固定會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生負(fù)面影響，但其他也有報(bào)道稱，并無(wú)負(fù)面影響，反而強(qiáng)調(diào)沒(méi)有充分的固定時(shí)間將影響甲醛交聯(lián)細(xì)胞蛋白質(zhì)。用甲醛固定組織樣本甚至是整個(gè)動(dòng)物樣本，是將其完全浸沒(méi)至體積比為4%的工作濃度的甲醛溶液中去。
醇類，特別是甲醇和乙醇，經(jīng)常用于免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中的細(xì)胞固定，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損傷細(xì)胞中的DNA。醇類一般不推薦用于固體組織標(biāo)本，因?yàn)椴荒芟窦兹┠菢涌梢员Ａ艚M織形態(tài)。此外，用醇類固定可導(dǎo)致組織發(fā)生收縮。丙酮不是常用的固定劑，一般只是用于快速冷凍組織的固定，因?yàn)樗纳票砦坏臋z測(cè)，也因此用于甲醇固定后的第二步固定。但是丙酮固定也能導(dǎo)致組織收縮。最后需要指出，在所有的固定方法中蛋白抗原性的保存必不可少，組織標(biāo)本可以保存在液態(tài)氮冷卻過(guò)的異戊烷中，并存儲(chǔ)在80oC直到后續(xù)處理。
方法使用范圍利與弊
甲醛類完整組織
簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)
改善了標(biāo)本的持久性
可能會(huì)破壞一些抗原表位 (見(jiàn)表位回復(fù)部分)
醇類細(xì)胞（免疫細(xì)胞化學(xué)）
在樣品中不會(huì)交聯(lián)DNA
不推薦用于組織標(biāo)本的固定，因?yàn)椴荒鼙３执纸M織形態(tài)
可能會(huì)引起組織收縮
丙酮冰凍組織或甲醇固定后的再固定
比單獨(dú)用快速冷凍固定效果更好
可能會(huì)引起組織收縮
快速冷凍需要保存抗原表位
快速有效地保存了抗原表位
必須保持組織一直處于冷凍狀態(tài)，產(chǎn)生了長(zhǎng)期儲(chǔ)存的問(wèn)題
表三：免疫組織化學(xué)固定方法。
包埋方法
組織在切片和染色前，必須先包埋到某種基質(zhì)中。石蠟是常用來(lái)包埋組織的。由于石蠟是疏水的，所以組織必須在一系列濃度梯度增高的乙醇中浸泡進(jìn)行脫水。在灌注石蠟前的倒數(shù)第二步是把組織標(biāo)本浸泡在二甲苯中使其完全脫水。在組織灌注石蠟后的短時(shí)間后，把它們放入（通常在一個(gè)小塑料盒內(nèi)）65%石蠟浴，然后再放入一個(gè)模具中，最后凝固成小塊，可經(jīng)切片機(jī)切片。石蠟包埋法因其簡(jiǎn)單、成本低、樣品保存持久、可行性高，因此很受歡迎。但石蠟包埋法也有缺點(diǎn)，即無(wú)法切的很薄（小于5微米）。為了能在高分辨率的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察切片，選擇塑料包埋更好，因?yàn)榭梢郧谐龊鼙〉慕M織切片，而且有助于保留組織形態(tài)。此外，塑料還可以成功包埋非常堅(jiān)硬的組織（如骨）并切片。然而塑料包埋并不常用，因其比石蠟更昂貴，且會(huì)干擾組織染色。先前已冰凍的組織可以用最佳切片溫度復(fù)合物（OCT）包埋，這是一種水溶性聚乙二醇樹(shù)脂溶液。用OCT包埋殘留少，從而背景信號(hào)低，所以是冷凍組織免疫組化染色的理想選擇。OCT包埋的一個(gè)明顯缺點(diǎn)就是在冰凍時(shí)變得不透明，在冰凍組織切片時(shí)定位較難。
方法適用范圍利與弊
石蠟甲醛固定組織
簡(jiǎn)易、可行性高
組織可以長(zhǎng)期保存
質(zhì)地較軟，切片難以很薄
需要固定，可能會(huì)破壞表位
塑料較硬的固定組織或需要切的很薄的組織樣本（如樣本需要電子顯微鏡觀察時(shí)）
質(zhì)地較硬，組織可以切的很薄（~微米）或者組織質(zhì)地較硬（如骨頭）
較昂貴
可能會(huì)干擾后續(xù)的染色實(shí)驗(yàn)
最佳切片溫度介質(zhì)(OCT)快速冰凍組織
低殘留、低背景信號(hào)
不透明從而使切片時(shí)難以定位組織
表四：免疫組織化學(xué)中的組織包埋方法。
表位回復(fù)
盡管使用福爾馬林固定有許多優(yōu)點(diǎn)，但是它卻破壞了抗原表位的三維結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)熱誘導(dǎo)表位回復(fù)（HIER）逆轉(zhuǎn)組織切片上的表位破壞。表位回復(fù)一般聯(lián)合采用加熱和酸/堿溶液;傳統(tǒng)方法常把切片放在pH=6的檸檬酸鈉緩沖溶液中加熱，但有時(shí)高pH的緩沖液對(duì)某些抗原表位的回復(fù)更有效。切片和緩沖液可放在非常熱的水浴、高壓鍋、高壓鍋或微波中加熱，這取決于可用的設(shè)備。
標(biāo)記/檢測(cè)
切片標(biāo)本可用好幾種方法進(jìn)行染色。通過(guò)酶標(biāo)抗體和比色底物進(jìn)行比色法是常用的。此法相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)穩(wěn)定，切片可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡讀片分析。但是內(nèi)源酶活性或鏈霉親和素試劑對(duì)內(nèi)源性生物素的非特異性結(jié)合，都可以提高背景信號(hào)強(qiáng)度，一般一個(gè)樣品只能檢測(cè)1-2個(gè)靶抗原。在這點(diǎn)考慮，通過(guò)免疫熒光或熒光染料標(biāo)記的抗體檢測(cè)標(biāo)本更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢酝瑫r(shí)標(biāo)記和檢測(cè)多種靶抗原。但必須小心的是，偶聯(lián)的熒光染料須避，以防熒光淬滅，因?yàn)檫@是不可逆的。
免疫金組織化學(xué)法可用作高分辨率分析。檢測(cè)樣品與偶聯(lián)有不同大小的金顆粒的抗體孵育，從而可在單個(gè)樣品中檢測(cè)不同抗原。這些顆?？梢员桓哽`敏度和高分辨率的電子顯微鏡掃描檢測(cè)到，從而可以在細(xì)胞和組織內(nèi)對(duì)靶抗原進(jìn)行非常精確的的定位。這種染色常用于驗(yàn)證亞細(xì)胞定位或特定的細(xì)胞衍生的結(jié)構(gòu)如外泌體。
方法適用范圍利與弊
酶聯(lián)免疫比色法標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡可以檢測(cè)1-2個(gè)靶抗原
成本相對(duì)較低
可及性高
固定可能會(huì)破壞表位
背景信號(hào)可能較高
不適合于多種靶抗原的檢測(cè)
酶聯(lián)免疫熒光法熒光/共聚焦顯微鏡
可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶抗原，檢測(cè)方法如FRET（取決于可用熒光濾光片種類）
可及性高
對(duì)染色樣品若操作或儲(chǔ)存不當(dāng)，易曝光引起熒光信號(hào)不可逆的淬滅
金標(biāo)記法電子顯微鏡
可在較高分辨率水平上，檢測(cè)1-2個(gè)靶抗原
代價(jià)昂貴
可及性不高，多目標(biāo)檢測(cè)時(shí)應(yīng)用受限。
表五：抗體相關(guān)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法。
鄰位連接技術(shù)
檢測(cè)和定性兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用總是很有挑戰(zhàn)性的。傳統(tǒng)的方法，如雙雜交試驗(yàn)，復(fù)雜而且呈現(xiàn)一定的局限性。鄰位連接測(cè)試（PLA）是一種快速，靈敏且容易的技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)相互作用。此外，它作為一種原位方法，有可能確定相互作用在貼壁細(xì)胞系和/或冷凍或石蠟包埋組織中的細(xì)胞內(nèi)位置。 PLA也可以定量和檢測(cè)在天然條件下單個(gè)內(nèi)源蛋白。PLA于2002年首次被弗雷迪克森等人描述。自那時(shí)以來(lái)，這種技術(shù)已成為在不干擾的條件下分析天然蛋白質(zhì)的相互作用，使用最廣泛的方法之一。PLA方法的基礎(chǔ)是使用寡核苷酸標(biāo)記的兩種抗體：這些抗體可以結(jié)合同一蛋白質(zhì)的不同表位或兩個(gè)不同蛋白質(zhì)。當(dāng)抗體接近彼此（約20-40納米距離），例如，當(dāng)兩個(gè)待分析蛋白質(zhì)在相互作用時(shí)，抗體上的寡核苷酸探針將與另外兩個(gè)“接頭寡核苷酸”雜交并結(jié)合，形成一個(gè)連續(xù)的環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)。這時(shí)，DNA聚合酶將放大該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)仍然共價(jià)地跟一個(gè)PLA抗體連接。擴(kuò)增的DNA分子可以使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光方法來(lái)檢測(cè)，從而直接顯示兩個(gè)待分析蛋白質(zhì)之間的相互作用。PLA方法應(yīng)用廣泛：最常用的是在臨床環(huán)境中確認(rèn)生物標(biāo)志物。 PLA也已用于研究特定蛋白質(zhì)在生物過(guò)程，如癌癥的發(fā)展中的作用。近日，PLA已得到改進(jìn)，直接檢測(cè)翻譯后修飾如乙?；?，磷酸化等。
體內(nèi)外的細(xì)胞學(xué)方法應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù) - 細(xì)胞群分析
這是在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床中抗體最常見(jiàn)的應(yīng)用方法，抗體可直接標(biāo)記在細(xì)胞表面，并通過(guò)流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)各種細(xì)胞群。對(duì)單細(xì)胞懸液直接進(jìn)行表面熒光抗體染色非常快捷;此染色方法不僅特異性好，而且靈敏度也高。此外，大多流式細(xì)胞儀能同時(shí)檢測(cè)3個(gè)或更多的熒光抗體，因此可以檢測(cè)到分化更細(xì)的細(xì)胞亞群及其分化、激活、凋亡相關(guān)的表面蛋白?？贵w必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格選擇，確保抗體所針對(duì)的靶抗原表位表達(dá)在細(xì)胞表面，以及阻斷劑（來(lái)源宿主的總免疫球蛋白IgG）應(yīng)避免與某些細(xì)胞（如各種類型的淋巴細(xì)胞）上的Fc受體發(fā)生非特異性結(jié)合的（圖9）。
圖 9. 磁性輔助細(xì)胞分選/流式細(xì)胞術(shù)中細(xì)胞表面分子標(biāo)記的流程示意圖。代表性流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖顯示了通過(guò)磁性輔助細(xì)胞分選后的CD8+ T細(xì)胞表面標(biāo)記的CD44和CD107a。
細(xì)胞分選和去除
熒光輔助細(xì)胞分選（FACS）是采用熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合特異性細(xì)胞，然后在特定熒光參數(shù)的基礎(chǔ)上分選出的單細(xì)胞。此方法既快捷且特異性高；但是需要特定的流式細(xì)胞儀。偶聯(lián)有磁珠的抗體也可用于分離或分選細(xì)胞，此過(guò)程稱為磁性輔助細(xì)胞分選（MACS）。在MACS過(guò)程中，細(xì)胞被標(biāo)記上帶有特定標(biāo)簽的細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體。標(biāo)記后的細(xì)胞隨后與小磁珠孵育，小磁珠會(huì)結(jié)合到抗體的標(biāo)簽上。最后通過(guò)一個(gè)強(qiáng)有力的磁鐵，可以非常容易地把標(biāo)記有磁性微珠的細(xì)胞從未標(biāo)記的細(xì)胞中分離出來(lái)（圖9）。
體內(nèi)研究應(yīng)用
為了研究某特定細(xì)胞群的功能，可以體內(nèi)給予抗體以去除此類細(xì)胞。例如在免疫學(xué)研究中，可以通過(guò)抗體在小鼠體內(nèi)去除特定的效應(yīng)淋巴細(xì)胞亞群，從而可以觀察機(jī)體對(duì)某種特定抗原的免疫應(yīng)答變化。同樣和上述體外研究類似，抗體可在體內(nèi)封閉細(xì)胞的表面受體或中和可溶性因子。應(yīng)用于此類方法的抗體，一般都是通過(guò)雜交瘤細(xì)胞大批量生產(chǎn)，以避免對(duì)異種抗原的反應(yīng)，而且需要純化以去除細(xì)胞培養(yǎng)試劑和其他可能的污染 。
質(zhì)譜
質(zhì)譜（MS）是一種分析技術(shù)，測(cè)量產(chǎn)物離子的質(zhì)量 - 電荷（M / Z）比例，以檢測(cè)，鑒別和量化在簡(jiǎn)單和復(fù)雜基質(zhì)中的分子。如今，MS是在廣泛的領(lǐng)域如蛋白質(zhì)組學(xué)，藥物開(kāi)發(fā)，環(huán)境分析，生物醫(yī)學(xué)研究中一個(gè)不可替代的工具。特別是蛋白質(zhì)分析，因?yàn)槭褂昧薓S儀器，經(jīng)歷了非常迅速的發(fā)展，因此可以更準(zhǔn)確和深入地定性類似的分子。然而，MS還有一些問(wèn)題待解決，如生成的數(shù)據(jù)的數(shù)量巨大，還有高豐度蛋白質(zhì)的存在掩蓋感興趣的蛋白質(zhì)。后一點(diǎn)已被MS針對(duì)性方法部分克服，如多/選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM/ SRM）。換句話說(shuō)，MS靈敏度有一些問(wèn)題，但也產(chǎn)生高度準(zhǔn)確和具體的數(shù)據(jù)。在此框架下，MS與基于抗體的親和力方法相結(jié)合，目標(biāo)分子先用基于免疫的方法捕獲，然后用MS分析，這個(gè)策略同時(shí)增加特異性和靈敏度。免疫測(cè)定和MS的結(jié)合開(kāi)發(fā)了幾個(gè)定量和定性的方法。
穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)和使用抗肽抗體捕獲
MS技術(shù)允許復(fù)雜樣品如血漿中的特定蛋白質(zhì)的的絕對(duì)定量。這可以通過(guò)使用合成肽和重同位素的混合物(Absolute QUAntification, AQUA)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在2004年Anderson等開(kāi)發(fā)了穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)和由抗肽抗體捕獲（SISCAPA）方法，目標(biāo)肽可通過(guò)使用固定在納米柱的抗肽抗體富集。該實(shí)驗(yàn)由4個(gè)步驟組成：?。┯靡鹊鞍酌赶鞍讟悠? 二）加入重同位素標(biāo)準(zhǔn)肽如AQUA; ⅲ）使用特異性抗肽抗體免疫富集iv）通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）對(duì)肽絕對(duì)定量。SISCAPA有若干應(yīng)用，例如用于乳腺癌患者的人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTfR）生物標(biāo)志物的確定和定量。然而，目標(biāo)MS測(cè)定的改善使免疫-MS的研究?jī)A向SISCAPA和MRM的結(jié)合，產(chǎn)生所謂的免疫M(jìn)RM。
免疫-MRM
多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（MRM-MS）是具有高特異性和精度的有針對(duì)性的定量MS方法。為了增加該測(cè)定的靈敏度，有可能通過(guò)免疫親和富集目標(biāo)肽的混合物，由此進(jìn)行免疫M(jìn)RM。該技術(shù)是可重復(fù)的，多重的，并具有高敏感性和特異性。廣泛延長(zhǎng)使用免疫M(jìn)RM的主要問(wèn)題是缺乏經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的特異于該技術(shù)的抗體?？贵w通常產(chǎn)生用于經(jīng)典免疫市場(chǎng)（例如酶聯(lián)免疫吸附，蛋白質(zhì)印跡），而對(duì)于免疫M(jìn)RM抗體應(yīng)該對(duì)應(yīng)短的直鏈的肽段。幾項(xiàng)研究已經(jīng)完成，調(diào)查在免疫M(jìn)RM中單克隆抗體的使用。顯然，這些產(chǎn)生的抗體優(yōu)于多克隆抗體。不幸的是，單克隆抗體價(jià)格昂貴而且它們由雜交系統(tǒng)生產(chǎn)的時(shí)間長(zhǎng)。最近，通過(guò)使用重組B細(xì)胞克隆的方法產(chǎn)生免疫M(jìn)RM單克隆抗體抗胰蛋白酶肽抗原的可行性已被證明。
免疫-MALDI
免疫-MALDI（iMALDI）類似于SISCAPA方法：即使是在這種情況下，使用抗肽抗體捕獲肽，但隨后富集的樣品點(diǎn)樣到一個(gè)特定的目標(biāo)并通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）MS分析。這種方法已應(yīng)用于診斷不同的病狀，如高血壓。然而，iMALDI的主要限制之一在于無(wú)法多重測(cè)定。
質(zhì)譜免疫
質(zhì)譜免疫測(cè)定（MSIA），于1995年提出，蛋白質(zhì)樣品用包被有特異性抗體的珠子溫育，然后洗脫。所獲得的樣品在全蛋白 “自上而下”的方法之后，可以直接用MALDI-TOF MS分析。MSIA方法還可以結(jié)合目標(biāo)MS方法，如SRM或MRM，洗脫樣品需經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化和隨后的MS分析。
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