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肝癌是全球第三位癌癥殺手，其治療方法以手術(shù)治療為最佳。但是即使早起切除，5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的比例仍超過50%。因此從根本上揭示肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)理對(duì)肝癌治療是十分重要的。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的最重要途徑，而轉(zhuǎn)化因子TGF-β是已知誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵因子。通過TGF-β誘導(dǎo)EMT是研究癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要手段，也是多數(shù)論文的主要選擇之一。

今天跟大家分享一篇論文，以miRNA主要研究對(duì)象，探討miRNA如何影響TGF-β誘導(dǎo)的EMT的效應(yīng)。

題目：MicroRNA-199b-5p attenuates TGF-β1-induced epithelial–mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma （回復(fù)20170622可下載文獻(xiàn)）

這篇文章以N-cadherin為起始研究分子，探討N-cadherin的臨床意義，分別在病人癌、癌旁組織，HCC細(xì)胞系檢測(cè)N-cadherin表達(dá)，并以DFS和OS為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定N-cadherin表達(dá)與預(yù)后關(guān)系。之后，作者通過數(shù)據(jù)庫篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方找尋到與N-cadherin表達(dá)相關(guān)的miRNA-miR-199b-5p。

同時(shí)通過臨床數(shù)據(jù)揭示miR-199b-5p具有明顯的臨床意義，且在HCC組織樣本中miR-199b-5p和N-cadherin表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性。接下來，文章以miR-199b-5p為核心分子，分別從表型，機(jī)制和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3方面揭示在HCC細(xì)胞和癌組織中，miR-199b-5p抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT的效應(yīng)。

下邊為大家仔細(xì)批講這篇論文的主要數(shù)據(jù)。

1.N-cadherin在HCC組織中高表達(dá)且和不良預(yù)后相關(guān)

采用免疫組化方法檢測(cè)了100個(gè)HCC病人癌、癌旁組織中N-cadherin的表達(dá)。結(jié)果如Figure 1A，1B所示，癌組織中N-cadherin表達(dá)量明顯升高。

采用Western blot方法在系列HCC細(xì)胞系中檢測(cè)N-cadherin的表達(dá)（Figure 1C），與正常肝細(xì)胞系HL7702相比，HCC細(xì)胞系中N-cadherin的表達(dá)升高。

進(jìn)一步研究N-cadherin表達(dá)與HCC病人預(yù)后的關(guān)系（Figure 1D），發(fā)現(xiàn)N-cadherin高表達(dá)的HCC病人無病生存期DFS和總體生存率OS都較短。

此外，還研究了N-cadherin表達(dá)與HCC病人臨床病理特征的關(guān)系，N-cadherin過表達(dá)與腫瘤分化程度，腫瘤多灶性和血管侵襲能力呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。

2.在HCC細(xì)胞中，N-cadherin是miR-199b-5p的靶標(biāo)

為了探討miRNAs是否參與N-cadherin表達(dá)調(diào)節(jié)，作者通過數(shù)據(jù)庫篩選出8個(gè)可能靶向N-cadherin的miRNA，分別是hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-190, has-miR-204, hsa-miR-211, hsa-miR-218 and hsa-miR-369-3p（Figure 2A）。

將以上8個(gè)miRNA mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞，作者采用Western blot檢測(cè)N-cadherin表達(dá)，結(jié)果顯示與其他7個(gè)相比，miR-199b-5p mimics轉(zhuǎn)染后，N-cadherin表達(dá)量下降最多（Figure 2B）。

miR-199b-5p和N-cadherin 3’-UTR 的堿基配對(duì)如圖Figure 2C所示。為了進(jìn)一步確定miR-199b-5p是否可調(diào)節(jié)N-cadherin表達(dá)，在HepG2和Huh7細(xì)胞中分別加入不同濃度的miR-199b-5p mimics和inhibitor后，檢測(cè)N-cadherin表達(dá)。

在miR-199b-5p高表達(dá)的HepG2中，N-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，而在miR-199b-5p表達(dá)較低的Huh7細(xì)胞中，N-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高（Figure 2D）。

而在HepG2中加入miR-199b-5p inhibitor或者Huh7細(xì)胞中加入miR-199b-5p后，N-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平與上述結(jié)果相反（Figure 2E）。

3.miR-199b-5p在HCC組織和細(xì)胞系中低表達(dá)

分析100個(gè)病人癌和癌旁組織中，miR-199b-5p在大部分HCC組織中表達(dá)降低。并且miR-199b-5p和N-cadherin的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)（Figure 3A，3B）。

進(jìn)一步研究miR-199b-5p表達(dá)與HCC病人預(yù)后的關(guān)系（Figure 1D），發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p低表達(dá)的HCC病人無病生存期DFS和總體生存率OS都較短（Figure 3C，3D）。

在HCC細(xì)胞系中，miR-199b-5p表達(dá)降低，且其表達(dá)和N-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)（Figure 3E，3F）。

4.miR-199b-5p過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凝集，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，N-cadherin表達(dá)能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)

在確定miR-199b-5p和N-cadherin的相互作用之后，作者開啟表型實(shí)驗(yàn)研究，這里供選擇3個(gè)表型：細(xì)胞凝集，細(xì)胞侵襲和細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

在miR-199b-5p過表達(dá)的細(xì)胞株中，細(xì)胞凝聚效應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降（Figure 4C，D，E，F(xiàn)）。而N-cadherin表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)以上表型（Figure 4I-L）。

5.miR-199b-5p緩解TGF-β1引起的EMT

在表型實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p可抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，而EMT是侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)之一。接下來的實(shí)驗(yàn)中作者在HCC細(xì)胞中加入TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞EMT。之后分別分析，miR-199b-5p和N-cadherin對(duì)TGF-β1引起的EMT的影響。結(jié)果表明miR-199b-5p過表達(dá)可緩解TGF-β1引起的EMT。同樣的結(jié)果在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：MicroRNA-199b-5p attenuates TGF-β1-induced epithelial–mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma