銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因?yàn)榭梢韵齇- ?2而被廣泛應(yīng)用于延緩衰老和控制炎癥，但是由于多種因素影響，尤其是Cu，Zn-SOD具有種質(zhì)特異性以及在體內(nèi)停留時(shí)間短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的應(yīng)用受到很大限制。定點(diǎn)突變技術(shù)是改造、優(yōu)化基因常用的手段，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有效方法，在醫(yī)學(xué)上還可用于基因治療等。目前常用的定點(diǎn)突變方法有寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變及盒式突變等〔1〕。但由于這些方法操作繁瑣，意外突變多等缺陷，使定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)受到一定限制。本研究采用一種近年來新的定點(diǎn)突變技術(shù)―快速PCR定點(diǎn)突變方法成功地對(duì)hCu，Zn-SOD進(jìn)行了基因改良(將hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密碼子突變?yōu)锳la密碼子，以提高其穩(wěn)定性)，同時(shí)對(duì)該定點(diǎn)突變技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行探討。
1 材料
11 菌株與質(zhì)粒 E.coli DH5α，由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位點(diǎn)，整個(gè)質(zhì)粒約33kb)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化于E.coli DH5α保存。
12 主要試劑 Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南華美生物工程有限公司);小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖?上海博亞生物技術(shù)有限公司);DNA Marker,T4DNA連接酶，Eco RI等常規(guī)酶(上海Sangon公司)。
13 pESOD質(zhì)粒提取及鑒定 用質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖袕暮琾ESOD質(zhì)粒的E.coli DH5α轉(zhuǎn)化菌里提取pESOD質(zhì)粒，取部分質(zhì)粒用EcoRI酶切后瓊脂糖電泳鑒定，另取部分質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
14 定點(diǎn)突變
141 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)hCu，Zn-SOD基因序列和定點(diǎn)突變的要求(將hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密碼子TGC突變?yōu)锳la密碼子GCC)設(shè)計(jì)出一對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物(正、反向)P1和P2,具體序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下劃線的堿基為突變位置。所有引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
142 PCR定點(diǎn)突變 整個(gè)反應(yīng)體系為50μl，其中含無菌去離子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、P2引物各1μl，pESOD質(zhì)粒1μl(約100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min，4℃保存。
143 轉(zhuǎn)化 用Dpn I限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli DH5α，涂布培養(yǎng)后隨機(jī)挑3個(gè)菌落并提取相應(yīng)質(zhì)粒，由上海博亞生物技術(shù)育限公司測(cè)序，測(cè)序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。
2 結(jié)果
21 提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后瓊脂糖電泳 質(zhì)粒大小為3300bp左右，證明所提取的質(zhì)粒就是pESOD質(zhì)粒，見圖1。
1：EcoRI酶切后的pESOD質(zhì)粒;2：Marker
圖1 pESOD質(zhì)粒經(jīng)EeoRI酶切后瓊脂糖電泳（略）
22 PESOD質(zhì)粒測(cè)序的部分結(jié)果 所測(cè)序列與文獻(xiàn)〔2〕報(bào)道的hCu,Zn-SOD序列對(duì)比完全一致，證明pESOD質(zhì)粒內(nèi)含的hCu,Zn-SOD基因完全正確。
23 定點(diǎn)突變后3個(gè)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果及突變前后序列對(duì)比(圖2) 3個(gè)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果有2種，分別和文獻(xiàn)〔2〕的hCu，Zn-SOD序列對(duì)比：其中1個(gè)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果和hCu,Zn-SOD基因序列完全一致，說明突變未成功；另外2個(gè)質(zhì)粒分別有2個(gè)堿基和hfu,Zn-SOD因序列不同，也就是Cys的密碼子TGC變成了Ala的密碼子GCC，其他序列與hCu，Zn-SOD基因一致，符合預(yù)期要求；圖2中沒有短線條相連的部分為突變前后2序列的不同之處。
A：突變后的hCu,Zn-SOD基因序列；B：hCu,Zn-SOD基因序列
圖2 hCu,Zn-SOD基因突變前后部分序列對(duì)比（略）
3 討論
通過快速PCR定點(diǎn)突變，本研究實(shí)現(xiàn)了把hCu,Zn-SOD基因中的Cys111突變?yōu)锳la111。整個(gè)突變過程只需要1次PCR反應(yīng)、1次DpnI酶解和1次轉(zhuǎn)化，即完成了定點(diǎn)突變，無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端處理，也無需進(jìn)行亞克隆等，大大減少了傳統(tǒng)定點(diǎn)突變的工作量，而突變成功率較高(本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑取的3個(gè)菌落中有2個(gè)是陽性突變菌落)，尤其適用于大腸埃希菌來源的DNA。
快速PCR定點(diǎn)突變的技術(shù)要點(diǎn)：(1)準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒必須是甲基化。(2)引物是一對(duì)包含突變位點(diǎn)的互補(bǔ)的(正、反向)核苷酸鏈，而且要比一般的PCR引物(18bp～21bp)長，一般要在25bp以上，因?yàn)橐镏泻型蛔兾稽c(diǎn)，和模板不能完全匹配。(3)須要高保真的DNA聚合酶如Pfu Turbo聚合酶。(4)PCR產(chǎn)物要用DpnI酶充分酶切消化，以提高突變檢出率。(5)PCR延伸步驟時(shí)間要充足；因?yàn)镻fu DNA聚合酶擴(kuò)增速率為05kb／min，比Taq酶慢1倍左右。(6)高保真Pfu DNA聚合酶酶量要比普通PCR所需的Taq酶多一些；因Pfu DNA聚合酶不但擴(kuò)增速率較慢，而且一步法PCR定點(diǎn)突變擴(kuò)增的是整個(gè)質(zhì)粒，故所需的總時(shí)間比一般的PCR時(shí)間要長很多，適當(dāng)增加酶量以補(bǔ)充長時(shí)間高溫下的酶活力損失。(7)克隆子最后需經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證；高保真不等于100％保真。本研究挑選測(cè)序的3個(gè)菌落中有1個(gè)是未突變的陰性菌落，故后續(xù)的測(cè)序步驟不能省略。
參考文獻(xiàn)
〔1〕 羅師平，冷希崗.基于PCR的體外誘變技術(shù)［J］.國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)，2005,28(3):188-192.
〔2〕 Sherman L,Dafni N,Lieman-Hurwitz,et al.Nucleotide sequence and expressionof human chromosome 21-encoded superoxide dismutase mRNA［J］.PNAS,1983,80(18):5465-5469.
(文濤編校)
*基金項(xiàng)目： 福建省自然科學(xué)基金(C0510004)
作者單位： 福建漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局農(nóng)食實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000；廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
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