來(lái)源/預(yù)立醫(yī)學(xué)
今天為大家?guī)?lái)的文章是近期發(fā)表在Oncotarget上一篇文章，作為一篇microRNA二代測(cè)序的范文，具有一定的參考價(jià)值。這篇文章的題目是：Next-generation sequencing identifies articularcartilage and subchondral bone miRNAs after ESWT on early osteoarthritis knee，影響因子5.008。
Oncotarget
IF：5.008
出版周期：雙月刊
審稿周期：平均2.2月
偏重方向：腫瘤、基因、靶向治療、自噬、干細(xì)胞、衰老等
通過(guò)二代測(cè)序驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的靶基因與多種生物學(xué)功能相關(guān)，包括軟骨發(fā)育、炎癥、免疫反應(yīng)、血管再生、細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄翻譯、基因表達(dá)、NTP結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)到、膠原纖維、凋亡、軟骨細(xì)胞分化、細(xì)胞分化、骨生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖等；
文章評(píng)價(jià)了ESWT 治療后關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的miRNA的表達(dá)模式。為關(guān)節(jié)炎和ESWT療法提供了潛在的新的標(biāo)志物和治療策略；
本文為高通量測(cè)序研究的一般思路，借鑒作用較強(qiáng)。
作者首先通過(guò)切除小鼠前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板制作早期關(guān)節(jié)炎（OA）模型，并對(duì)部分小鼠行體外沖擊波治療（ESWT）。
軟骨和骨分別分三組開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，sham為正常對(duì)照組，OA為關(guān)節(jié)炎組，OA+SW為ESWT治療組。每組選用四只小鼠，取其軟骨組織及軟骨下骨組織，提取RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)其miRNA表達(dá)譜。
分別對(duì)軟骨及軟骨下骨展開(kāi)分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)置的3組數(shù)據(jù)兩兩進(jìn)行比較，尋找差異表達(dá)的miRNA，并預(yù)測(cè)其靶基因及潛在功能。作者對(duì)于認(rèn)為比較重要的miRNA，開(kāi)展了RT-PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析三組中軟骨及骨組織的表達(dá)差異。
OA的原發(fā)病變?cè)陉P(guān)節(jié)軟骨，蛋白多糖是其主要成分之一。作者在造模完成后，首先做了免疫組化，檢測(cè)造模是否成功。染色劑為番紅素O，軟骨蛋白多糖會(huì)被染成紅色，而軟骨下骨為藍(lán)色。OA組紅色明顯缺失，圖中用黑色箭頭指示。
作者分別取三組的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織，提取RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)miRNA，并進(jìn)行聚類(lèi)分析。左圖為軟骨中3組樣品miRNA的表達(dá)譜，有圖為軟骨下骨組織的表達(dá)譜（紅色為表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色表達(dá)下調(diào)）。
不論是軟骨還是骨組織，三組中miRNA的表達(dá)模式都存在較大差異。且ESWT治療后，軟骨與骨中，激活或抑制的miRNA是不同的。
作者采用Sham vs OA、Sham vs OA+WT、OA vs OA+WT的分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出了三組分析中顯著上調(diào)及顯著下調(diào)的miRNA。
作者挑選4種miRNA在軟骨和骨組織中進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，這4種miRNA與多種因子相關(guān)，如蛋白聚糖、VEGF、MMP13、代謝作用等。
TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)， UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋?zhuān)@著上調(diào)和下調(diào)的miRNA主要與以下功能相關(guān)，包括軟骨發(fā)育、炎癥、免疫反應(yīng)、血管再生、細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄翻譯、基因表達(dá)、NTP結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)到、膠原纖維、凋亡、軟骨細(xì)胞分化、細(xì)胞分化、骨生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖等。并且ESWT治療后，表達(dá)發(fā)生改變的miRNA主要參與軟骨發(fā)育與骨重建這兩個(gè)功能。
這篇文章中規(guī)中矩，代表了高通量測(cè)序類(lèi)文章的一般思路，不僅適用于骨關(guān)節(jié)炎，對(duì)于其他領(lǐng)域的精準(zhǔn)醫(yī)療都有較強(qiáng)的借鑒作用。
高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)（'Next-generation' sequencing technology），能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。
目前較常用的平臺(tái)，Roche 454是焦磷酸測(cè)序、Illumina Solexa是合成測(cè)序、ABI SOLiD是連接測(cè)序。Roche 454讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，便于拼接；SOLiD讀長(zhǎng)短但Reads數(shù)多，且每個(gè)堿基讀取2遍，準(zhǔn)確率較高；Illumina Solexa讀長(zhǎng)、Reads數(shù)及準(zhǔn)確率居中，但是其成本較低，目前應(yīng)用較為廣泛。
在基因組水平上對(duì)還沒(méi)有參考序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序(de novo)，獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對(duì)有參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測(cè)序及外顯子組測(cè)序，掃描并檢測(cè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。
在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從而開(kāi)展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)等研究；進(jìn)行非編碼測(cè)序(small RNA)，如：小RNA、lncRNA、circRNA等，比較其表達(dá)差異及發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)分子。
在表觀遺傳方面，結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化或免疫共沉淀等，可檢測(cè)基因組上的甲基化位點(diǎn)。
在微生物領(lǐng)域，對(duì)16S或18S等核糖體RNA擴(kuò)增測(cè)序，可分析其微生物多樣性、物種豐度等；宏基因組測(cè)序可得到微生物的功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：http://www.impactjournals.com/oncotarget/index.php?journal=oncotarget&page=article&op=view&path%5b%5d=11331
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