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青貯過程是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵體系，如何快速的讓乳酸菌迅速地成為優(yōu)勢(shì)菌群主導(dǎo)發(fā)酵過程是提高青貯質(zhì)量，減少干物質(zhì)和能量損失的核心問題，為彌補(bǔ)發(fā)酵底物中乳酸菌數(shù)量的不足，添加優(yōu)良乳酸菌以調(diào)控該微生物發(fā)酵體系是一個(gè)行之有效的方法，已經(jīng)有許多成功的例子。如在意大利黑麥草（Lolium multiflorum）中添加乳酸菌使PH值及揮發(fā)性氮與全氮比值降低，提高了L（+）乳酸的生成比率，改善了青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。一般認(rèn)為，同型發(fā)酵乳酸菌因乳酸產(chǎn)率高，能迅速降低青貯飼料的pH值而抑制有害微生物的活動(dòng)，從而能改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)；異型發(fā)酵乳酸菌雖然累積乳酸的能力不如同型發(fā)酵乳酸菌，但其除了能產(chǎn)生乳酸外，還可產(chǎn)生能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的乙酸，從而抑制青貯開封后的二次發(fā)酵，提高有氧穩(wěn)定性，減少取用和飼喂過程中的營養(yǎng)損耗。目前，已報(bào)道能提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌主要是布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri），如全株玉米（Zea mays）中添加布氏乳桿菌進(jìn)行青貯，可降低青貯飼料的乳酸濃度，提高乙酸濃度，降低酵母菌數(shù)量，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。目前，國內(nèi)外已有許多生物添加劑成功應(yīng)用于飼料青貯，但由于這種生物添加劑受環(huán)境影響較大，出現(xiàn)了一些不同的研究結(jié)果。因此，篩選更多的能促進(jìn)青貯發(fā)酵、改善青貯飼料品質(zhì)并具有抑制青貯飼料二次發(fā)酵潛力的優(yōu)勢(shì)乳酸菌勢(shì)在必行。

作為青貯添加劑的優(yōu)良乳酸菌必須具有較強(qiáng)的附著能力和生長能力，而從青貯原料或青貯飼料中分離篩選乳酸菌最容易滿足以上要求。雖然關(guān)于玉米青貯的乳酸菌已有較多報(bào)道，但還沒有適合甘肅地區(qū)全株玉米青貯的乳酸菌接種劑，本實(shí)驗(yàn)室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得5株青貯用優(yōu)良乳酸菌，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）B3-1產(chǎn)酸較快、較多，且其培養(yǎng)上清液對(duì)供試的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌、大腸桿菌和酵母菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）B1-7、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）B2-3、屎腸球菌（Enterococcus faecium）B5-2、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）E2-3分別在分離的同類型乳酸菌中產(chǎn)酸和抑菌特性均最優(yōu)。分別將以上5株乳酸菌作為接種劑，在實(shí)驗(yàn)室條件下開展全株玉米青貯試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在青貯過程和有氧暴露后，分別添加5種篩選乳酸菌的各處理組乳酸菌總數(shù)均顯著高于對(duì)照組，而好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，pH亦低于對(duì)照組，其中植物乳桿菌B3-1處理組差異最為顯著，表明這5株乳酸菌尤其植物乳桿菌B3-1具有提高青貯飼料品質(zhì)和抑制二次發(fā)酵的潛力。為驗(yàn)證其對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵過程營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的影響，本研究通過跟蹤分析青貯過程不同階段青貯飼料的營養(yǎng)成分、有機(jī)酸和氨態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化，綜合評(píng)價(jià)接種的乳酸菌對(duì)全株玉米青貯的調(diào)控效果，進(jìn)一步驗(yàn)證和篩選在青貯發(fā)酵過程不同階段起主要作用的優(yōu)良乳酸菌，為進(jìn)一步組合制備更適合甘肅地區(qū)全株玉米青貯用復(fù)合乳酸菌接種劑提供依據(jù)。

1.1 菌種與儀器

供試乳酸菌包括：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1、屎腸球菌B5-2、發(fā)酵乳桿菌E2-3均由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

儀器：723N可見分光光度計(jì)、DZ-300A多功能真空封口機(jī)、22cm×28cm聚乙烯包裝袋、茂福爐、蛋白消煮爐、DHG-9000A立式電熱鼓風(fēng)干燥箱、E2695高效液相色譜儀。

1.2 青貯飼料的調(diào)制

2012年9月，自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院產(chǎn)學(xué)研基地（甘肅省臨洮縣）采集蠟熟期青貯用全株玉米，經(jīng)切割機(jī)切成1～2cm左右混勻即為青貯原料，用微波爐進(jìn)行快速干燥，以掌握含水量，當(dāng)萎蔫至含水量達(dá)到70％左右（過夜）進(jìn)行青貯。各供試乳酸菌用MRS（deMan-Rogosa-Sharpe）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，調(diào)濃度為1×10⁹ cfu/mL，按5 mL/kg青貯原料添加，即5×10⁶ cfu/g。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7組（B1-7）；戊糖片球菌B2-3組（B2-3）；植物乳桿菌B3-1組（B3-1）；屎腸球菌B5-2組（B5-2）；發(fā)酵乳桿菌E2-3組（E2-3）；不添加乳酸菌的液體MRS培養(yǎng)基為對(duì)照組（CK）。

將菌液用滅菌噴壺均勻噴灑于切碎的玉米秸稈上混勻。按500g/袋裝入聚乙烯包裝袋中，按緊、壓實(shí)，利用真空封口機(jī)抽氣封口，每個(gè)處理30個(gè)重復(fù)。于恒溫環(huán)境（20℃）中進(jìn)行發(fā)酵，分別在青貯第3、7、15、30天取樣，每處理每次隨機(jī)取3袋，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 營養(yǎng)成分分析

采集的青貯樣品于65℃烘干后粉碎過0.425ｍｍ（40目）篩，干物質(zhì)（dry matter，CP）、粗蛋白（crude protein，CP）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）等的分析按照《動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》中的方法進(jìn)行。

1.4 發(fā)酵品質(zhì)分析

乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）的含量分析采用液相色譜法，在蘭州大學(xué)化學(xué)測(cè)試中心進(jìn)行；氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH₃-N）含量測(cè)定采用苯酚－次氯酸鈉比色法進(jìn)行，以NH₃-N 占總氮（total nitrogen，TN）的百分比表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 玉米青貯原料營養(yǎng)成分

青貯前全株玉米粉碎后測(cè)定的營養(yǎng)成分結(jié)果如表1所示，原料的含糖量和含水量符合青貯飼料調(diào)制要求。

2.2 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段ＤＭ的影響

不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段DM的影響見表2，各處理組和對(duì)照組的DM含量隨發(fā)酵進(jìn)行逐漸減小，青貯前7ｄ各處理組DM含量與對(duì)照組差異不顯著；從第15天開始有差異，到第30天時(shí)各處理組的DM含量與對(duì)照組相比均差異顯著（P＜0.05），其中B3-1處理組的DM含量最高，青貯過程中DM損失最少，為2.22％，而對(duì)照組的損失為4.15％。

2.3不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段WSC的影響

不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段WSC的影響見表3，隨著青貯時(shí)間延長，各處理組和對(duì)照組的WSC含量均逐漸降低，前7d下降較快，之后下降速度減慢，且對(duì)照組的WSC含量始終高于各處理組。青貯初期，B1-7處理組和B5-2處理的WSC含量顯著低于其他處理組和對(duì)照組，從第15天開始，B3-1處理組的WSC含量最低，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），但與其他處理組差異不顯著。

2.4 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段CP的影響

不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段CP的影響見表4，各處理組和對(duì)照組的CP含量隨青貯時(shí)間延長均逐漸緩慢降低，青貯最初7ｄ，各處理組和對(duì)照組的CP含量無顯著差異，從第15天開始，對(duì)照組的CP含量顯著低于各處理組；第30天時(shí)對(duì)照組的CP含量是原料的91.0％，相對(duì)下降最多，而B3-1處理組變化最小，依然含有原料的96.2％。

2.5 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段NDF的影響

由表5可見，在青貯過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行各處理組和對(duì)照組的NDF含量均逐漸增加，最初7ｄ，變化幅度較小，且各組間無顯著差異；從第15天開始，變化幅度明顯增加，其中B3-1處理組變化最大，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與其他各處理組差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段ADF的影響

由表6可見，在青貯過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行各處理組和對(duì)照組的ADF含量均逐漸增加，青貯初期各組間無顯著差異；從第15天開始，B3-1處理組的ADF含量顯著高于其他處理組和對(duì)照組（P＜0.05），但其他處理組間及其與對(duì)照組差異不顯著。

2.7 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段NH₃-N的影響

不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯不同階段NH₃-N的影響見表7，青貯期各處理組和對(duì)照組的NH₃-N含量均逐漸增加，且對(duì)照組始終最高，與各處理組差異顯著（P＜0.05），B3-1處理組始終較低。

2.8 不同乳酸菌對(duì)全株玉米青貯飼料有機(jī)酸的影響

青貯發(fā)酵第30天產(chǎn)物中有機(jī)酸含量結(jié)果見表8，各處理組及對(duì)照組均未檢測(cè)到丙酸和丁酸，B3-1、B2-3和B5-2組的LA含量最高，顯著高于對(duì)照組和其他兩組（P＜0.05），B3-1和B5-2組AA含量最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與其他3個(gè)處理組差異不顯著（P＞0.05）。B3-1組LA+AA的含量最高，對(duì)照組最低，B2-3組的LA/AA最高，B1-7組LA/AA最低。

3討 論

4結(jié) 論