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1942 年,加拿大學(xué)者Duff用口服疫苗預(yù)防硬頭鱒(Salmo gairdneri)的癤瘡病獲得成功,開(kāi)創(chuàng)了魚(yú)類免疫的先河。至今,魚(yú)類免疫主要包括注射、浸泡、口服等,前兩種免疫方法已得到廣泛應(yīng)用,但胃酸及消化酶等破壞抗原,魚(yú)類口服免疫效果不理想。目前,由于包裹技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,新的包裹材料不斷開(kāi)發(fā),魚(yú)類口服抗原經(jīng)包裹之后,能更有效地抵擋胃酸及各種消化酶的破壞,抗原物質(zhì)緩慢而持久地釋放,使得免疫保護(hù)的時(shí)間和效果大幅提高。筆者從魚(yú)類口服免疫的機(jī)制及影響因素和提高口服免疫效果的幾種方式等方面綜述了魚(yú)類口服免疫的研究進(jìn)展。

 

1 　口服免疫的機(jī)制

 

關(guān)于口服疫苗的免疫機(jī)制,川合研兒等曾作過(guò)如下的推測(cè):疫苗經(jīng)過(guò)腸壁而進(jìn)入魚(yú)體內(nèi),刺激魚(yú)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,這些抗體的一部分通過(guò)粘液分布到體表。當(dāng)魚(yú)體再次接觸到該類病原時(shí),即同粘液中的抗體結(jié)合而失去感染力,消化管和體表獲得局部免疫。高等脊椎動(dòng)物的抗原經(jīng)口服進(jìn)入消化道之后,先到達(dá)腸相關(guān)淋巴組織(GALT),結(jié)合呼吸道黏膜和泌尿生殖道黏膜等形成一道黏膜免疫網(wǎng),成為阻止病原入侵的第一道屏障。然后,腸黏膜中豐富的抗原提呈細(xì)胞(M細(xì)胞)將抗原俘獲運(yùn)輸?shù)骄奘燃?xì)胞和淋巴結(jié),刺激B細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),產(chǎn)生IgA中和侵入機(jī)體的病原體。

黏膜免疫在高等脊椎動(dòng)物研究較多,腸黏膜攝取病原體,誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞,然后由誘導(dǎo)位點(diǎn)IgA產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白(S-IgA),S-IgA協(xié)同一些免疫活性細(xì)胞CD4+,CD8+等對(duì)入侵病原體進(jìn)行吞噬、阻抑粘附、溶解、中和等清除。但魚(yú)類相關(guān)的研究比較少,Stlouis-Cormier提出魚(yú)類存在S-IgA的假說(shuō),認(rèn)為皮膚和膽汁中的免疫球蛋白有較大的區(qū)別。他們用間接熒光抗體技術(shù)在虹鱒(Oncorhynchus mykiss) 黏膜漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)S-IgA。有學(xué)者認(rèn)為魚(yú)類與高等脊椎動(dòng)物黏膜免疫相類似,但需要證實(shí)。Companjen等研究證實(shí),魚(yú)類后腸為抗原吸收和加工的主要部位。抗原可被后腸的巨噬細(xì)胞攝取,能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Grove S等揭示了大西洋比目魚(yú)( Hippoglossus hippoglossus)的后腸、鰓等組織含有IgM細(xì)胞。

魚(yú)類的口服免疫轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制目前尚不很清楚。一般認(rèn)為魚(yú)類缺乏象高等脊椎動(dòng)物腸道內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞M細(xì)胞,所以口服抗原在腸道蠕動(dòng)作用下,小分子及可溶性物質(zhì)可經(jīng)腸黏膜細(xì)胞間的空隙滲透進(jìn)入血液;大分子顆粒則由巨嗜細(xì)胞吞噬后,在細(xì)胞內(nèi)加工,提呈到達(dá)相關(guān)的淋巴組織,也可經(jīng)細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn),運(yùn)輸?shù)窖h(huán)系統(tǒng),經(jīng)血液或淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。魚(yú)類口服免疫同樣既能產(chǎn)生全身免疫,也能產(chǎn)生局部的黏膜免疫。真骨魚(yú)類的后腸在免疫中起很重要作用,巨嗜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性顆粒細(xì)胞在后腸內(nèi)層黏膜均有發(fā)現(xiàn)。且已在鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、金魚(yú)( Carassius auratus)等多種魚(yú)類的免疫作用已得到證實(shí)。羅曉春等對(duì)斜帶石斑魚(yú)( Epinephelus coioides)皮膚、眼角膜、鰓、前腸及后腸等相關(guān)免疫組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明黏膜組織中存在杯狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞,具有完成免疫應(yīng)答的細(xì)胞基礎(chǔ)。此外,在黏膜層還有與哺乳動(dòng)物腸相關(guān)淋巴組織(GAL T)相類似的相關(guān)淋巴促進(jìn)細(xì)胞。因此真骨魚(yú)類雖然不擁有腸相關(guān)淋巴組織,但其腸黏膜內(nèi)層的獨(dú)特功能同樣能夠通過(guò)腸黏膜內(nèi)的巨嗜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞傳遞和表達(dá)免疫反應(yīng)。研究者也已經(jīng)證實(shí),真骨魚(yú)類黏膜巨嗜細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫方面的必要性。真骨類魚(yú)腸黏膜中嗜酸性顆粒細(xì)胞(EGC)在黏膜免疫中起重要作用,這種細(xì)胞類似于哺乳動(dòng)物的偽足細(xì)胞,但不釋放組胺而且有自己的結(jié)構(gòu)特性。EGC細(xì)胞生成于發(fā)育早期,平時(shí)游走于身體各部,當(dāng)進(jìn)食或者有異己蛋白入侵時(shí)集中到腸黏膜處對(duì)異物進(jìn)行吞噬。Picchietti等用滅活的食果糖乳桿菌(Lactobacillus fructivorans )以口服免疫的方式接種黑鯛(Sparus auratus),除了腸道Ig陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)量提高外,嗜酸性細(xì)胞數(shù)量也顯著提高。龔暉等用免疫刺激復(fù)合物(Immuno stimulating complexes,ISCOMs)以浸浴和口服的方式免疫歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla),免疫鰻T淋巴細(xì)胞(Thymus-derived lymphocyte cell, T-cell) 增殖轉(zhuǎn)化能力顯著提高。以上結(jié)果提示經(jīng)黏膜免疫接種疫苗,不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,而且能夠誘導(dǎo)包括細(xì)胞免疫在內(nèi)的其他類型的免疫應(yīng)答,提示細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在免疫保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用。

 

2 　影響魚(yú)類口服免疫效果的因素

魚(yú)類口服免疫的第一道障礙來(lái)自于消化道酶的破壞。胃蛋白酶在胃壁細(xì)胞分泌的鹽酸作用下迅速激活并對(duì)抗原蛋白進(jìn)行酶解;水解酶也在酸的作用下將蛋白質(zhì)進(jìn)行更進(jìn)一步的水解為胨,破壞抗原的完整性,部分或全部失去抗原的免疫原性。經(jīng)蠕動(dòng)胃內(nèi)容物排空進(jìn)入腸道,胰液內(nèi)的肽鏈內(nèi)切酶將蛋白質(zhì)分解為多肽、小肽和少量的氨基酸。肽類再由胰液和腸液的羧肽酶、氨肽酶、三肽酶等水解為氨基酸;脂質(zhì)則由胰液中的脂酶和膽汁共同作用分解為2-單酸甘油酯和甘油。有試驗(yàn)證明, 用HGG作為免疫抗原免疫虹鱒,之后定期收集胃、幽門(mén)垂、腸的黏膜內(nèi)容物和血液。結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃和幽門(mén)垂處超過(guò)90%的HGG片段分子量超過(guò)140kDa(完整的HGG分子為150kDa),而到了前腸37%的HGG片段分子量約45.60kDa,小分子肽類和氨基酸在前腸被吸收,后腸大分子片段比例相對(duì)增加,超過(guò)140kDa的片段約占35%。血清中的大分子片段約為12%,有部分HGG片段大于200kDa,推測(cè)可能是因?yàn)镠GG與其他分子相結(jié)合所致。

口服免疫的第二道障礙是腸黏膜的上皮細(xì)胞。高等脊椎動(dòng)物有90%的小肽在腸道紋狀緣被降解。和哺乳動(dòng)物的小腸上皮一樣,真骨魚(yú)類的上皮細(xì)胞和紋狀緣也含有堿性磷酸酶(A KP)。該酶與腸上皮的消化吸收有關(guān)。哺乳動(dòng)物只有在哺乳期后腸的胞飲才吸收完整的蛋白, 而鲇魚(yú)(Clarias lazera)、鱸魚(yú)( Perca fluviatilis)、虹鱒和鯉魚(yú)等多種魚(yú)類均有發(fā)生,且不分發(fā)育階段,從幼體至成熟,后腸細(xì)胞的胞飲都一直存在,最初認(rèn)為無(wú)胃魚(yú)類均有小腸上皮細(xì)胞的胞飲作用,后來(lái)證實(shí)了有胃魚(yú)類也如此。標(biāo)記發(fā)現(xiàn),HRP在腸黏膜內(nèi)壁細(xì)胞內(nèi)降解為次級(jí)結(jié)構(gòu)或者小肽,但是加大劑量能在血液中檢到完整的HRP,這就意味著有很大一部分蛋白質(zhì)抗原在被上皮細(xì)胞吞噬之后在細(xì)胞內(nèi)被降解,這也是魚(yú)類需要較高飼料蛋白的原因之一,因此要克服上皮細(xì)胞的胞飲對(duì)蛋白質(zhì)的降解, 必須加大抗原蛋白的口服劑量。

 

3 　提高口服免疫效果的措施

3. 1 　包裹

胃酸的作用和蛋白酶的水解使抗原到達(dá)吸收部位后完整性和免疫部位已經(jīng)被破壞。為了保護(hù)抗原的完整性使其順利到達(dá)吸收區(qū)域,可采用包裹抗原的方式,做成微囊顆粒,抵御消化道的消化作用?？捎玫陌牧嫌心c衣、淀粉、明膠、藻酸鹽和聚合材料PLG、PLEA等。包裹的材料必須符合3個(gè)條件: ①能夠自然降解; ②無(wú)毒,對(duì)魚(yú)體無(wú)任何負(fù)作用; ③不影響抗原的免疫原性,材料便宜,簡(jiǎn)單易得。常用的幾種包裹方式有:

(1) 海藻酸鈉　海藻酸鈉系多糖類化合物,常用稀堿從褐藻中提取而得?？扇苡诓煌瑴囟鹊乃?、乙醇、乙醚及其他有機(jī)溶劑;不同分子量產(chǎn)品的粘度有差異。海藻酸鈉穩(wěn)定、無(wú)毒、成膜性或成球性較好,是最常用的囊材與載體材料。2%的海藻酸鈉水溶液用磁力攪拌溶脹過(guò)夜后,加入6%的PVPK30混勻,然后加入10¹²cfu/ml的菌懸液,攪拌均勻。以1 ml/min的速度進(jìn)料,用自動(dòng)噴干儀噴霧干燥,噴干儀進(jìn)風(fēng)口溫度為120～130℃,出風(fēng)口為65～75℃,干燥得到1～3μm的微囊顆粒,以10¹⁰cfu/kg拌料投喂。Joosten等用海藻酸鈉包裹溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)同時(shí)免疫有胃魚(yú)虹鱒和無(wú)胃的鯉魚(yú),3周后取血和腸黏膜ELISPOT法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),抗體效價(jià)遠(yuǎn)比對(duì)照組未包裹抗原免疫的要高,同時(shí)取黏膜和鰓切片特異性染色,結(jié)果漿細(xì)胞大量增加。李新華等用海藻酸鈉包裹嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) 疫苗口服免疫銀鯽( Carassius auratus gibelio),結(jié)果發(fā)現(xiàn),微膠囊疫苗組魚(yú)血清抗體效價(jià)較高,峰值為1∶80,且維持時(shí)間較長(zhǎng);各腸段的黏膜抗體中,后腸黏膜抗體效價(jià)最高,微膠囊疫苗組峰值達(dá)1∶320,前腸的腸黏膜抗體效價(jià)也有一定的水平為1∶40;腸道免疫組化試驗(yàn)也得到相似結(jié)果:在不同時(shí)間對(duì)前、中、后腸切片進(jìn)行免疫組化染色,從光鏡下觀察到腸黏膜外層和黏膜下層均有陽(yáng)性著色,以包裹全菌苗為最多,未包裹菌苗較少。由此得出結(jié)論:口服海藻酸鈉包裹后的抗原不僅能激發(fā)魚(yú)體全身免疫,還能誘發(fā)局部黏膜免疫,口服免疫將是一種行之有效的免疫方法。

(2) 聚交酯醣酯聚合物(Polylactide-co-glycolide, PLG) 目前,用得最為廣泛的是聚交酯醣酯聚合物類。它安全、降解性好(活體中2～3個(gè)月降解)。PL G必須先用有機(jī)溶劑溶解。乙酸乙酯(EA)毒性小,口味好,但對(duì)PLG的溶解性和沸點(diǎn)不如二氯甲烷(DCM)。PLG的包裹過(guò)程包括PLG的溶解,乳劑的形成,乳劑的穩(wěn)定,有機(jī)溶劑的清除以及顆粒性狀的檢驗(yàn):先將PLG溶解在有機(jī)溶劑(DCM)內(nèi)與抗原的水溶液相混合,攪拌形成油包水的乳劑,然后加穩(wěn)定劑聚乙烯醇(PVA)之后通過(guò)蒸發(fā)(一般采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀清除殘留的有機(jī)溶劑)或者萃取將有機(jī)溶劑分離,干燥成1～10μm的抗原微粒, PLG的操作流程見(jiàn)圖1,定量檢查包裹效果和顯微觀察微粒性狀見(jiàn)圖2 。然后拌入飼料投喂。

圖1 　PL G包裹疫苗的操作流程

圖2 　掃描電鏡下的PL G包裹顆粒

(3) 脂質(zhì)體　磷脂分散在水中自然形成多層囊泡,每層均為脂質(zhì)的雙分子層;囊泡中央和各層之間被水相隔開(kāi),雙分子層厚度約為4nm。這種具有類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子小囊稱為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是納米級(jí)材料,使用時(shí)先用氯仿溶解,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后與菌懸液混合,攪拌形成乳劑,噴霧干燥即得抗原微囊顆粒,與飼料拌勻即可。脂質(zhì)體包裹的疫苗不僅可以延緩被消化酶破壞降解的時(shí)間,同時(shí)也是一種很好的疫苗佐劑,能增強(qiáng)口服疫苗的免疫原性,刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。

此外,用來(lái)包裹的材料還有腸衣、明膠和淀粉等等。但是, Park等用腸衣包裹創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)制成弧菌微囊疫苗免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus),發(fā)現(xiàn)免疫效果反不如不包裹直接口服,原因是腸衣的保護(hù)影響了抗原的釋放。因此不同的抗原應(yīng)采取不同的包裹材料和包裹方式。同時(shí), 要不斷開(kāi)發(fā)新的包裹材料, 如PLEA和PLEG等。張小江等采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-co-polyet hylene glycol, PELA),包裹哈維氏弧菌(V. harveyi)重組外膜蛋白Omp K后,制備成PELA-Omp K微球。斜帶石斑魚(yú)口灌四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TRITC)熒光素標(biāo)記的Omp K-PELA微球后,第1d在其后腸觀察到大量紅色熒光微球,第3d熒光微球數(shù)量明顯減少,第7d熒光微球基本消失。免疫組化研究結(jié)果表明,口服PELA-Omp K組在斜帶石斑魚(yú)后腸組織黏膜層可見(jiàn)較強(qiáng)的棕黃色陽(yáng)性著色?？诜ELA-Omp K組血清抗體效價(jià)顯著高于口服Omp K蛋白溶液組與對(duì)照組;口服PELA-Omp K組的粘液抗體效價(jià)顯著高于口服Omp K蛋白組。

 

3. 2 　改善腸道環(huán)境

胃壁細(xì)胞分泌的胃酸對(duì)胃蛋白酶的活性和蛋白質(zhì)的水解起著至關(guān)重要的作用。胃酸的分泌使胃內(nèi)pH穩(wěn)定在3.38(虹鱒),而胃蛋白酶在pH為3～5時(shí)才具有活性,因此,Lavelle等用碳酸氫鈉和甲氰咪胍與抗原一起拌于飼料投服,發(fā)現(xiàn)每尾虹鱒(約200g/尾) 添加30mg 1h后胃內(nèi)pH升至7.24。不同時(shí)間取胃腸黏膜內(nèi)容物和血液,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析發(fā)現(xiàn),抗原分子的完整性明顯增加,同樣在添加了75mg/尾的甲氰咪胍1h之后,胃內(nèi)pH升至6. 98,采取同樣的方式收集分析胃腸黏膜內(nèi)容物也發(fā)現(xiàn)抗原HGG的完整性和大分子片段比對(duì)照組有顯著提高。有研究發(fā)現(xiàn),用辣根過(guò)氧化酶(HRP)和大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)一起拌料口服, SBTI能增加HRP在黏膜中的水平。在已知的蛋白酶活性區(qū)域,SBTI也能為HRP提供持續(xù)的保護(hù)作用。添加Mega-9和人造洗滌劑均能使血液中的HRP含量提高一倍,改善胃腸環(huán)境。另外,添加了氫氧化鋁或者霍亂B毒素也能提高一些魚(yú)類對(duì)HGG的吸收,增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)。

 

3. 3 　多種免疫方式相結(jié)合

免疫接種的目的是為激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫作用,誘發(fā)免疫應(yīng)答來(lái)抵御病原體的侵襲。采用一種方式往往不能達(dá)到預(yù)期效果,因此可采用多種方式相結(jié)合強(qiáng)化免疫刺激。采用先浸泡后口服的免疫方式,對(duì)魚(yú)的類結(jié)癥進(jìn)行免疫預(yù)防,提高了口服免疫效果?；【呙缃莺笤倏诜庖邭W鰻,免疫之后收集血液、黏膜,測(cè)抗體效價(jià)、細(xì)菌存活率及氧化酶活性,并進(jìn)行動(dòng)物半數(shù)致死量試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)浸泡之后口服效果比單浸泡和口服好,而且抗體濃度高峰持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),凍干苗比超低溫冷凍的疫苗效果好。另外,還可以采用多次免疫的方式,連續(xù)投喂和間隔投喂,持續(xù)時(shí)間根據(jù)需要而定。采用HRM菌苗口服免疫虹鱒,每周5d ,2周后,接著間隔每周投喂1次,攻毒時(shí)保護(hù)力達(dá)90%以上。用FSA菌苗口服免疫虹鱒,投菌苗60μg/(d·尾),連續(xù)25d ,能刺激魚(yú)體產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)。用溶藻弧菌菌苗口服免疫幼齡鯉魚(yú)與黑鯛,10星期后注射免疫,從組化及抗體效價(jià)分析得出,58日齡幼魚(yú)免疫效果較好。

 

4 　小結(jié)

魚(yú)患病之后藥物的治療效果往往難如人意,因此魚(yú)類免疫被越來(lái)越多的人所關(guān)注,盡管注射和浸泡都已經(jīng)取得了成功,但由于操作所需的人力和物力,注射免疫一般只限于親魚(yú),而浸泡也只適用于魚(yú)苗放養(yǎng)階段。相比之下,魚(yú)類口服免疫操作較簡(jiǎn)單、方便,抗原需要量則遠(yuǎn)不如浸泡免疫,可大大地減輕對(duì)魚(yú)類的刺激,減少勞動(dòng)強(qiáng)度和成本,易于重復(fù)強(qiáng)化免疫,是一種較好的免疫方式。

魚(yú)類的口服免疫不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生全身免疫作用,同時(shí)也能誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生黏膜免疫。黏膜是病原體首先接觸和聚居之地,因此黏膜免疫能在第一時(shí)間對(duì)侵入機(jī)體的病原體進(jìn)行阻擋和排除。但由于魚(yú)類的種類繁多,各種魚(yú)的機(jī)體和消化道系統(tǒng)也各有差異,例如鯉科魚(yú)類沒(méi)有真正的胃,無(wú)胃酸產(chǎn)生,腸道環(huán)境接近中性,因此投喂口服疫苗可以不予考慮酸水解和胃酶對(duì)抗原的破壞作用,而鮭科魚(yú)類如虹鱒,有胃,內(nèi)環(huán)境呈酸性,必須選擇更合理的抗原處理方式。此外,魚(yú)類消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能不同,口服免疫的效果也差異很大。如草魚(yú)(Ctenopharyngoclon godoniclells)腸道結(jié)構(gòu)特殊,吸收部位主要在前腸而對(duì)抗原破壞相對(duì)較弱,因此草魚(yú)的口服免疫能取得較好的效果,而大多數(shù)魚(yú)類吸收大分子抗原是在后腸,這就增加抗原在消化道內(nèi)存留的時(shí)間,被水解的可能性增加,所以必須對(duì)抗原加以保護(hù)以便順利到達(dá)吸收區(qū)域。研究也發(fā)現(xiàn),魚(yú)類發(fā)育早期,消化道功能還不夠完善,各種消化酶的功能不健全,對(duì)抗原的破壞較小,抗原的完整性相對(duì)較好。魚(yú)體的大小也是影響魚(yú)類免疫的因素之一,幼體階段誘發(fā)的免疫應(yīng)答效果較好,因此在魚(yú)類發(fā)育早期進(jìn)行口服免疫能取得較好的效果。另外,魚(yú)類口服免疫有效劑量,免疫時(shí)間也因魚(yú)的種類而異,魚(yú)類的免疫特性又錯(cuò)綜復(fù)雜,口服免疫還有許多領(lǐng)域需要研究。