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核酸化學(xué)

第二章  核酸化學(xué)nucleic acid

本章教學(xué)目的要求:

掌握核酸的種類和化學(xué)組成,DNA的一級結(jié)構(gòu)的特點、表示方法及二級結(jié)

構(gòu)要點和穩(wěn)定因素,RNA的二級結(jié)構(gòu),核酸的主要理化性質(zhì),了解核酸的分布,DNA、RNA的三級結(jié)構(gòu),核酸分離純化的一般方法和理化特性的應(yīng)用。為進一步學(xué)習(xí)核酸代謝,遺傳信息的表達打好基礎(chǔ)。

重點、難點:

核酸的分子結(jié)構(gòu)和主要性質(zhì),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和tRNA的“三葉草”結(jié)構(gòu)。

 

第一節(jié)   核酸的種類分布與化學(xué)組成

 

一、核酸化學(xué)的興起與發(fā)展

    核酸(nucleic acid)是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生物大分子化合物,存在于一切生物的細胞中,是一種重要的生命物質(zhì),是細胞核的主要成分。

    1869年,瑞士的Basel(巴塞爾)大學(xué)的生理化學(xué)家Miescher(米歇爾)用胃蛋白酶水解在外科繃帶上取得的化膿細胞,從細胞核分離出一種含磷的酸性物質(zhì),他稱之為“核素”(核質(zhì))。即核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合體。此后,科學(xué)家們相繼在各種動植物組織中找到了這類核酸,并進一步分離其中的蛋白質(zhì),從而得到了核酸。以后開始了化學(xué)成分的研究。

    18851907年間,德國生理學(xué)家Kossel(柯塞爾)等對核酸化學(xué)組成進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)核酸水解產(chǎn)物中有四種堿基:腺嘌呤胸腺嘧啶 尿嘧啶 野靛堿。其學(xué)生Levene(勒溫尼)發(fā)現(xiàn)除了堿其外,還有核糖和磷酸,并于1929年發(fā)現(xiàn)還有一種失去一個氧原子的五碳糖——脫氧核糖。分別稱為核糖核酸和脫氧核糖核酸。

    1930年以后,Levene繼續(xù)研究了核酸的結(jié)構(gòu):一個核糖一方連著堿基,另一方與磷酸成酯,形成一個核苷酸單元。

    1944年—1951年,Avery等逐步證實了DNA是遺傳信息的攜帶者。

    1953年,Watson ,Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,使生物化學(xué)進入了分子水平時代。

    1958年,MeselsonStahl用同位素標記證明DNA的復(fù)制方式是半保留復(fù)制。

    50年代以后,飛速發(fā)展,不僅分離出各種核酸,而且隨著核酸測序(堿基序列)、人工合成所取得的成功,發(fā)展產(chǎn)生了遺傳工程(基因工程)等生物技術(shù),將越來越廣泛地發(fā)揮作用。

    目前,基因結(jié)構(gòu)及基因表達和調(diào)節(jié)已成為現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中心。

    1980年,生物學(xué)家、諾貝爾獎得主H.Dulbecco提出人類基因組計劃,HGP,計劃弄清楚人的23對染色體,30億對堿基的排列順序。

    1990年,美國決定用30億美元、15年時間完成HGP,中國于1999年加入并承擔(dān)1%測序任務(wù)(中科院遺傳研究中心北京中心楊煥明教授,3號染色體短臂,3000bp30Mb),現(xiàn)已基本完成。

    后基因組時代:研究中心從揭示序列轉(zhuǎn)移到整體水平對基因組功能的研究。產(chǎn)生了:

    功能基因組學(xué):蛋白質(zhì)組學(xué),細胞內(nèi)基因表達的所有蛋白質(zhì)。

    結(jié)構(gòu)基因組學(xué):RNA組學(xué),研究細胞全部功能RNA的結(jié)構(gòu)、作用。

遺傳圖:

以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標記為路標,以遺傳學(xué)距離為圖距繪制的基因組圖。此處的遺傳多態(tài)性定義為在某個遺傳位點上具有一個以上的等位基因,且其在群體中出現(xiàn)的頻率均高于1%。而遺傳學(xué)距離則是指在減數(shù)分裂事件中,兩個位點之間進行交換、重組的百分率,并規(guī)定1%的重組率為1cM。

 

物理圖:

以一段已知核苷酸序列的DNA片段為標記,MbKb作為圖距繪制的基因組圖。該DNA片段稱序列標記位置(sequence tagged site,STS)。

物理圖的意義在于STS可把經(jīng)典遺傳學(xué)與細胞遺傳學(xué)的位點信息轉(zhuǎn)化為基因組位點的物理信息,基于STS位點信息的相連片段群又提供了研究區(qū)域的實驗材料,以這些片段的材料便可進行該區(qū)域的基因組研究或在該區(qū)域?qū)ふ倚禄颉?span lang="EN-US">

 

轉(zhuǎn)錄圖:

mRNA先分離、定位,再轉(zhuǎn)錄成cDNA,這就構(gòu)成一張人類基因的轉(zhuǎn)錄圖,cDNA片段又稱表達序列標簽(exprossed sequence tagEST),因此轉(zhuǎn)錄圖也稱為表達序列圖。

由于cDNA具有組織、生理與發(fā)育階段的特異性,因此EST除提供序列信息外,同時也提供了該基因表達的組織、生理狀況與發(fā)育階段的信息。

 

序列圖:

人類基因組核苷酸序列圖即是分子水平的最高層次的、最詳盡的物理圖,由總長度為1m左右、約由31億核苷酸組成。當(dāng)前人類基因組全序列圖實際上是一個代表性人類個體的序列圖,因為所有人類基因個體的基因位點都是相同的,不同族種、不同個體的基因差異,以及正常致病基因的差異,只是同一位點上的等位基因的差異。

 

二、核酸的種類和分布

1、種類

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)、核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA){信使RNAmRNA、轉(zhuǎn)移RNAtRNA、核糖體RNArRNA

2、分布

DNA的分布

細胞生物:

原核細胞DNA主要存在于擬核(類核)、質(zhì)粒中。大腸桿菌中的環(huán)狀雙鏈DNA分子也叫染色體DNA。

 真核細胞DNA主要存在于細胞核的染色質(zhì)中,線粒體和葉綠體等少量細

胞器中亦有。

病毒生物:

部分病毒中分布有DNA

RNA的分布

90%RNA存在于細胞質(zhì)中,少量分布于胞核中。

部分病毒中分布有RNA。

三、核酸的化學(xué)組成

DNA、RNA都是以核苷酸為基本單元的大分子。核苷酸單元又由五碳糖、磷酸、堿基三者結(jié)合而成。

堿基

核苷

核酸       核苷酸          戊糖

磷酸

(一)五碳糖(戊糖,pentose

DNA分子中的五碳糖為脫氧核糖,RNA分子中的五碳糖為核糖,這也正是把核酸分為RNADNA的根本依據(jù)。

結(jié)構(gòu)有鏈式和環(huán)式兩種。

(二)堿基(base

核酸中的堿基分為兩類:嘌呤堿和嘧啶堿

DNA分子中的主要堿基有四種:腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胞嘧啶C、胸腺嘧啶T

RNA分子中的主要堿基有四種:腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胞嘧啶C、尿嘧啶U

嘌呤(Purine

嘧啶(Pyrimidine

稀有堿基:又叫微量堿基或修飾堿基,是主要堿基的衍生物。

如次黃嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、二氫尿嘧啶、咖啡因(1,3,7—三甲基黃嘌呤)、茶堿(1,3—二甲基黃嘌呤)、N6—甲基腺嘌呤(m6A)、N6—異戊烯基腺嘌呤(i6A)、N7—甲基鳥嘌呤(m6A)。

 

 

磷酸

O                  O                    O

                             解離           

HO— P—OH       HO— P —            — P—O

      |                  |                     |

     OH                OH                  O   

                  

 

 

(四)核苷(nucleoside)——戊糖與堿基結(jié)合物

1、核苷的形成

核苷由戊糖與堿基以“CN”糖苷鍵結(jié)合而成。

核苷可以看成是嘌呤堿N9位或嘧啶堿N1位上的H原子被戊糖基C1位取代而成的化合物。

2、基本核苷的命名、符號

核苷名稱由相應(yīng)的堿基名和戊糖名加苷而產(chǎn)生,全名為“某堿基核苷”或“某堿基脫氧核苷”,并可簡化為“某苷”或“脫氧某苷”。如腺苷、脫氧腺苷。

核苷符號依據(jù)相應(yīng)堿基而來,對于脫氧核苷則在堿基代號前加“d”。

DNA、RNA分別有四種核苷

3、核酸中的稀有核苷(修飾核苷)

假尿苷ψ      胸苷T

縮寫代號的表示方法:

1)核苷的堿基上的H被其它基團取代的表示方法:

將堿基取代基、取代位置和取代基數(shù)目寫在核苷單字代號(AT、GC、U)的左邊,用小寫英文字母代表取代基(甲基m、甲硫基ms、異戊烯基I、乙?;?/span>ac、羥基oh、羧基c、氨基n、硫基s

如:m62A表示腺苷嘌呤環(huán)上的第6位有兩個甲基取代基,即N6,N6-二甲基腺苷,右上角的數(shù)字為取代基在核苷分子堿基環(huán)上的位置,由下角的數(shù)字為取代基的數(shù)目。

甲基m

乙?;?/span>ac

氨基n

甲硫基ms

羥基oh

硫基s

異戊烯基i

羧基c

 

2)核苷的糖分子中—OH基的H被其它基團取代后的產(chǎn)物的表示方法

在其核苷單字代號的右邊加上代表取代基的小寫字母代號,如:Am表示腺苷的第2位上OH基的H被甲基所取代。

(五)核苷酸(nucleotide)——核苷與磷酸結(jié)合物

核苷酸是形成核酸大分子的基本單元??梢詫⒑塑账峥醋骱塑盏牧姿狨?。

核糖分子中除了C1位—OH成苷外,還有C2\C3C5位三個自由羥基,可以分別生成相應(yīng)位的核苷酸。

脫氧核糖分子中則還有C3C5位兩個自由羥基,能分別生成相應(yīng)位核苷酸。

1、核苷酸的名稱

某苷—(酯化位)—磷酸     (酯化位)—某苷酸

如:腺苷-磷酸      5′—腺苷酸

2、核苷酸的代號

一般以核苷號加“MP”形成 ,如5′—AMP。常見核苷酸多為5′—核苷酸,通常不寫出酯化位置(5′略去)。如5AMP寫成AMP。

DNARNA分別有四種基本核苷酸。

四、細胞內(nèi)的其他核苷酸及核苷酸衍生物

1、多磷酸核苷酸

常見的核苷酸為一磷酸單核苷酸,如5AMP。一磷酸核苷酸可與一分子磷酸結(jié)合成二磷酸核苷酸,如ADP;二磷酸核苷酸再與一分子磷酸結(jié)合成三磷酸核苷酸,如ATP。ADP ATP即為多磷酸核苷酸。

重要生理功能:

參與能量代謝。ATP是能量通貨;

各種三磷酸核苷酸參與DNA、RAN的生物合成(作原料);

參與其它合成。如UTP參加糖轉(zhuǎn)化、合成,CTP參與嘌呤、蛋白質(zhì)的合成;

作輔酶的結(jié)構(gòu)成分。如NAD+、NADP+

2、環(huán)化核苷酸

1950Earl Sutherland(薩瑟蘭德)在激素研究中偶爾發(fā)現(xiàn)腺苷3′,5′—一磷酸,即cAMP充當(dāng)了激素第二信使的作用,并放大了激素信號。

另外 cGMP,有人認為它與cAMP的作用相拮抗。

cAMP                      cGMP

3、其他核苷酸

主要起調(diào)節(jié)作用,如:

ppGpp:鳥苷—5′—二磷酸—3′—二磷酸

pppGpp:鳥苷—5′—三磷酸—3′—二磷酸

A5pppp5AAp4A):二腺苷—5′,5″—p′,p4四磷酸,

認為是體內(nèi)的調(diào)節(jié)因子,因為蛋白質(zhì)合成的第一步即氨基酸活化時形成,能代替ATP使氨基酸活化,使氨基酸連接到tRNA上去。在哺乳動物中與細胞生長速度之間有明顯的聯(lián)系,很可能是一種起促進作用的信號分子。

 

核酸在生命過程中起著攜帶和傳遞遺傳信息的重要作用,但只有4種主要的核苷酸,如何完成這一任務(wù)呢?這與核酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),即核苷酸的測序和空間結(jié)構(gòu)。

 

第二節(jié)   DNA的分子結(jié)構(gòu)

 

一、DNA的一級結(jié)構(gòu)

(一)核苷酸之間的連接方式

一個核苷酸的3′—羥基和相鄰一個核苷酸的5′—磷酸基團以酯鍵相連。把該鍵稱為3′,5′—磷酸二酯鍵。

明確以下幾點:

1、DNARNA各自的基本單元之間的連接都是如此,形成線形多核苷酸鏈;

2、無論核苷酸鏈有多長,總有兩端:5—端和3—端;

5—端:該末端的脫氧核苷酸5位上的磷酸基團不再與另一個脫氧核苷酸相連。

3—端:該末端的脫氧核苷酸3位上是羥基,不再連接另一個脫氧核苷酸。

3、對DNA分子而言,其鏈上只有四種基本核苷酸。

(二)DNA的一級結(jié)構(gòu)

1、DNA的一級結(jié)構(gòu)及表示方法

DNA的一級結(jié)構(gòu)是指DNA分子中脫氧核苷酸的排列順序,也叫序列。

各種DNA分子具有各不相同的核苷酸序列,即不同的一級結(jié)構(gòu)。

事實上,所有核酸鏈上的戊糖與磷酸是按一定規(guī)則交替重復(fù)的;無一定規(guī)則的是各種核酸鏈上的側(cè)面堿基順序。所以,分析核苷酸序列也即分析堿基序列,是分子生物學(xué)上的一個重要課題,并已取得了突破性進展。關(guān)于測序方法、原理參考:StryerL.生物化學(xué),唐有祺等譯,北京大學(xué)出版社,1990,459-461。

關(guān)于核酸一級結(jié)構(gòu)的表示

簡化表示法:豎線表示戊糖碳鏈,原子編號自上而下,C1連著堿基,AT、G、C表示DNA中的四種堿基,P代表磷酸殘基,磷酸二酯鍵自豎線中部引出(C3)對角至相鄰豎線下段(C5),對角線中間為P,如:

 

DNA                                  RNA

縮寫式:根據(jù)簡化式從左至右按序?qū)懗鰤A基符號(代表核苷),以P代表磷酸基,P寫在堿基符號左邊時表示P結(jié)合在C5位上,堿基符號右邊的P表示與C3結(jié)合。如:

PAPCPGPT 

    PACGT

    PACGT

    PACGTOH

簡化式的讀向:從左至右表示的堿基序列是5      3′。

2DNA的堿基組成規(guī)律-------Chargaff規(guī)則

1950年,Erwin Chargff(查爾加夫)用紙層析法分析多種生物DNA分子的組成成分,發(fā)現(xiàn)所有物種內(nèi)的DNAAT,GC之比值都接近1.0。他對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出提供了重要依據(jù)。要點如下:

堿基當(dāng)量定律  同一種生物的不同組織或器官的DNA的堿基組成相同,并且,ATmol數(shù)相等,即A=TACmol數(shù)相等,即G=C,從而,AG=CT。

不對稱比率   不同種生物的DNA堿基組成存在差異。  

3、真核生物和原核生物DNA的區(qū)別

真核生物:DNA和組蛋白結(jié)合;

原核生物:沒有組蛋白。

真核生物:主要分布在細胞核中;

原核生物:分布在擬核。

二、DNA的二級結(jié)構(gòu)

(一)DNA二級結(jié)構(gòu)的典型      雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

1953年,Jamse.WstsonFrancis.Crick在前人研究的基礎(chǔ)上,推導(dǎo)出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型及DNA復(fù)制機制。

1、雙螺旋模型要點

兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸向右盤旋形成右手雙螺旋;

雙螺旋的骨架是由磷酸和脫氧核糖組成,位于外側(cè),堿基位于螺旋內(nèi)側(cè),配對平行,與軸垂直;

雙螺旋平均直徑為20Å,螺距為34Å,螺旋一周包含10個堿基對,相鄰堿基距離為3.4Å,之間旋轉(zhuǎn)角度為36º;

雙螺旋結(jié)構(gòu)上有兩條螺形凹槽,大溝和小溝,對于DNAPRO結(jié)合時的相互識別很重要,利于遺傳信息的傳遞與表達。

堿基按互補配對原則進行配對,AT配對,之間形成兩個氫鍵,CG配對,之間形成三個氫鍵。

互補配對原則的重要性:

A:當(dāng)一條多核苷酸鏈的序列被確定以后,即可推知另一條互補鏈的序列;

B:是遺傳信息傳遞的分子基礎(chǔ),DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄和翻譯都以堿基互補原則為基礎(chǔ)進行。

2、穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的力

有利的:

1)堿基堆積力:主要作用力,包括堿基之間的范德華力和堿基疏水作用。堿基堆積后,在雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個強大的疏水區(qū),產(chǎn)生疏水作用。

2)堿基對之間的氫鍵: 基本作用力

3)離子鍵

不利的:

1)靜電斥力:磷酸基團之間;

2)堿基分子內(nèi)能。

平衡的結(jié)果。

3、生物學(xué)意義

第一次描述了DNA分子的結(jié)構(gòu),提出了遺傳信息的儲存方式以及DNA的復(fù)制機理,對DNA復(fù)制、基因遺傳、RNA翻譯、基因表達、調(diào)控等方面的研究都奠定了基礎(chǔ),揭開了分子生物學(xué)研究的序幕,為分子遺傳學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

見圖

(二)DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

指在不同提取條件下得到的同種DNA分子的二級結(jié)構(gòu)亦不一定相同。

1B-DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,在92%相對濕度下對生理鹽液抽出的DAN纖維的X-射線衍射圖為依據(jù)。

2、A-DNA75%相對濕度,以NaK、、Cs作反離子。

3、C-DNA66%相對濕度,以Li作反離子。

    A、B、CDNA均為右手雙螺旋,只是大溝,小溝深淺,寬窄不一,堿基角度,螺距等不同。

4、Z-DNA   

1979年底,A.Rich等對人工合成的DNA片段制成晶體,經(jīng)X射線衍射得到一種左手雙螺旋,磷酸根和核糖的骨架呈現(xiàn)連寫的Z字形,呈鋸齒狀,如“之”字而得名。它只有一個小溝。

在某些天然DNA中已發(fā)現(xiàn)了ZDNA片段,并執(zhí)行某種細胞功能,但不十分清楚,可能與基因調(diào)控有關(guān)。

BDNAZDNA之間可以相互轉(zhuǎn)化。

并非所有DNA都呈雙螺旋結(jié)構(gòu),如噬菌體DNA,單鏈。

5、三鏈DNA    DNA的三股螺旋

DNA三股螺旋簡介

DNA雙螺旋基礎(chǔ)上形成。通常僅是一段三鏈區(qū),而不是整個分子成三鏈。

按來源分為:分子間三股螺旋(插入),分子內(nèi)三股螺旋(雙鏈之一回折)

三鏈區(qū)的堿基配對:CG=C、CG=G、T=A=TT=A=A。見圖

應(yīng)用意義及前景:利用插入第三鏈片段達到攜帶切割劑,從而定點剪切的目的;插入“第三股”達到破壞病毒等目的,都是阻止遺傳信息的表達。

6、四鏈DNA

基本結(jié)構(gòu)單元是鳥嘌呤四聯(lián)體在不同鹽濃度和濕度下形成不同的構(gòu)象。

可能在穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)以及復(fù)制中保持DNA的完整性等方面起作用。

三、DNA的三級結(jié)構(gòu)-----------超螺旋結(jié)構(gòu)

1、雙鏈DNA在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步扭曲折疊形成三級結(jié)構(gòu)。

2、環(huán)形雙鏈DNA分子可以進一步扭曲成超螺旋結(jié)構(gòu),首尾可共價連接成環(huán)狀,分為負超螺旋(“-”自下而上向左旋 正超螺旋(“+”自下而上向右旋),大多數(shù)天然存在的DNA分子都是負超螺旋。

3、超螺旋的作用:

(1)可以影響DNA雙鏈的解螺旋。

當(dāng)DNA雙鏈螺旋與超螺旋方向相反時,促使雙鏈解螺旋。如在DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄中。

(2)結(jié)構(gòu)上使DNA有更緊密的形狀,在組裝中具重要作用。

比伸展的DNA分子更緊密,體積小。如:DNA長度為0.1----3100mm,而細胞大小只有1---10μm(原核)10---100μm(真核)。

見圖

 

第三節(jié)   RNA的分子結(jié)構(gòu)

 

一、RNA的一級結(jié)構(gòu)

RNA的一級結(jié)構(gòu)是指各核糖核苷酸在多核苷酸鏈上的連接順序。

區(qū)別于DNA的是單核苷酸的種類不同。

二、RNA的空間結(jié)構(gòu)

一般RNA的二級結(jié)構(gòu)

RNA單鏈在空間結(jié)構(gòu)上,沒有DNA雙鏈分子的規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)。但是,分析發(fā)現(xiàn),許多RNA單鏈可以在許多區(qū)域發(fā)生單鏈自身的回折,同一鏈上的堿基配對,從而產(chǎn)生部分雙螺旋結(jié)構(gòu)和各種有一定代表性的空間構(gòu)象。

RNA雙螺旋區(qū)域,堿基配對原則是:A-U,G-C之間形成氫鍵,不能配對的堿基所在區(qū)域則呈環(huán)狀突起。

見圖,tRNA的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)

1RNA分子具有統(tǒng)一的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計  

1965Holley(霍利)測出第一個tRNA分子的堿基順序------酵母丙氨酸tRNA的順序。 三葉草形,約50%的堿基能配對。

共同特征如下:

單鏈,含有7493個核苷酸;

含有較多稀有堿基(715)。它們是A、UG、C的甲基、二甲基衍生物。如次黃嘌呤、一甲基次黃嘌呤、二氫尿嘧啶;

5′端有磷酸殘基,多為PG;

3′端順序為CCAOH。在蛋白質(zhì)合成中,tRNA轉(zhuǎn)運氨基酸時就將活化氨基酸接在3′—OH上;

一條多核苷酸鏈自身回折遇到能配對的堿基形成螺旋區(qū)(臂或莖);不能配對的地方形成突環(huán)區(qū)(環(huán)),形成四環(huán)四臂結(jié)構(gòu)  

呈三葉草形:

氨基酸臂(接受莖):七對堿基,末端為—CCA,能接受活化的氨基酸;

二氫尿嘧啶環(huán)(DHU環(huán)或D環(huán)):812個核苷酸,因具兩個二氫尿嘧啶而得名。與分類有關(guān),通過二氫尿嘧啶臂(D莖)與其它相連;

反密碼環(huán):7個核苷酸,中部為反密碼子,與mRNA密碼子配對。通過反密碼莖與其它相連;

額外環(huán):318個核苷酸,是tRNA分類的依據(jù)。

TψC環(huán) 7個核苷酸,可能與在核糖體處落下有關(guān)。通過TψC臂與其它相連。

2、tRNA的三級結(jié)構(gòu)

20世紀70年代中期,以Rich等率先對tRNA晶體結(jié)構(gòu)進行X-光衍射研究。

呈倒“L”形,3CCA—OH末端位于L的短線一端,反密碼環(huán)位于L的長線一端,DHUTψC環(huán)形成L的轉(zhuǎn)角。

作用力:

(1)氫鍵和堿基的上下堆積,以及疏水性等使得倒“L”結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在。

(2)除了堿基對的氫鍵外,還有非尋常的氫鍵:不互補的堿基間GG、AAAC等的氫鍵;核糖磷酸骨架與堿基骨架之間的氫鍵。

見圖

(三)mRNA的結(jié)構(gòu)特征

mRNA一般呈單鏈,分子大小不一??梢宰陨砘卣鄢梢话?/span>RNA的二級結(jié)構(gòu),如發(fā)夾式。

據(jù)研究,真核mRNA是在細胞核及線粒體中產(chǎn)生,然后進入細胞質(zhì)和核糖體的。

由于mRNA在代謝上較不穩(wěn)定,故分離和測定方法上存在一些問題,用不同方法測得的大小各異。

真核生物細胞中mRNA的特征結(jié)構(gòu):

13′—PolyA尾:在3′端有一段約20200個腺苷酸組成的多聚腺苷酸。它能提高mRNA的穩(wěn)定性。使之順利進入細胞質(zhì),并轉(zhuǎn)移到核糖體。

2、5′—帽子結(jié)構(gòu):7—甲基鳥苷(m7G)以5′—5′焦磷酸鍵連接于mRNA5′端;鄰近的核糖2′—OH亦可—CH3化形成帽子。  帽子結(jié)構(gòu)可以保護mRNA5′端不被5′核糖核酸酶等水解,從而提高mRNA的穩(wěn)定性??赡芘c蛋白質(zhì)合成有關(guān),因為mRNA須與核糖體40s亞基結(jié)合。

3、原核細胞和真核細胞mRNA在結(jié)構(gòu)上的不同:

                     原核細胞                    真核細胞

順反子多少        多,可編碼多條肽鏈              單順反子

帽子結(jié)構(gòu)               沒有                        

3PolyA             沒有                        

(四)rRNA的結(jié)構(gòu)

存在于核糖體中,占其重量的2/3,與蛋白質(zhì)結(jié)合。

單鏈,有螺旋區(qū),發(fā)夾形結(jié)構(gòu),構(gòu)象不穩(wěn)定。

核糖體由大小兩個亞基組成,均含有rRNA。原核生物:30S16srRNA)、50S(5s、23srRNA);真核生物:40S18srRNA)、60S5s5.8s、28srRNA)、。

主要功能:是形成核糖體,作為蛋白質(zhì)合成的場所。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn):某些rRNA具有酶的功能,叫做核酶。

()核內(nèi)小分子RNAsnRNA

只存在于真核生物細胞中,只有100200個核苷酸。

能與一些特殊的蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物(核內(nèi)小分子核糖蛋白體snRNP),在真核生物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核內(nèi)不均一RNAhnRNA)加工為成熟mRNA中起重要作用。

 

第四節(jié) 核酸的理化性質(zhì)與分離提純和應(yīng)用

 

一、一般性質(zhì)

(一)            一般物理性質(zhì)

 

 

 

 

 

核酸

性質(zhì)

DNA

         RNA

純品物理狀

白色粉末

白色纖維狀

溶液粘度

分子大小

1.6×106D——

2.2×107D

tRNA  2500030000D

mRNA  0.5×106D

rRNA   0.61.8×106D

水溶性

微溶

微溶

鹽溶性

易溶

易溶

有機溶劑

不溶(75%C2H5OH

不溶(50%C2H5OH

 

(二)兩性性質(zhì)

由于核酸,核苷酸中含有堿基和磷酸基,而呈兩性電離,是兩性電解質(zhì)。磷酸基比堿基更易解離,故核酸表現(xiàn)為酸性。

(三)核酸的水解

在一定條件下,磷酸二酯鍵、糖苷鍵被破壞,核酸可水解成核苷酸,核苷,堿基,戊糖,磷酸等各種成分。

1、堿水解:室溫,稀堿下,RNA可水解為核苷酸;DNA不能水解。

2、酸水解:稀酸長時間或高溫或強酸處理核酸,可促使核酸發(fā)生糖苷鍵、二酯鍵水解。

3、酶水解:核酸酶、核苷酸酶等,詳細見“核酸代謝”。

(四)沉降特性

由于溶液中的核酸在離心場中可下沉,因而可用超離心法純化核酸,沉降速度有差異:RNA>環(huán)形DNA>線形DAN>PRO或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸分離,也可測沉降系數(shù)和分子量。

RNA:蔗糖梯度超離心

DNA:氯化銫梯度超離心

(五)粘度

DNA粘度比RNA大。當(dāng)受熱或其他因素,由螺旋變?yōu)闊o規(guī)則時,粘度下降,可作變性指標。

 

二、核酸的紫外吸收性質(zhì)

由于核酸分子中具有的共軛雙鍵體系(單雙鍵交替的鍵),而導(dǎo)致核酸具紫外吸收特性,對240nm290nm的紫外線有強烈吸收峰,最大吸收峰在260nm。

DNA的減色效應(yīng):在核酸的紫外吸收特征上,對于DNA而言,DNA分子的紫外吸光率小于形成該DNA分子的各單核苷酸的吸光率之和。這種現(xiàn)象叫減色效應(yīng)。

DNA的增色效應(yīng):DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解螺旋(如高溫),使分子中堿基堆積程度下降,從而發(fā)生紫外吸光率增加。這種現(xiàn)象叫增色效應(yīng)。

利用紫外吸收特性可以分析核酸的變性和復(fù)性等。用紫外分光光度計測定含量,鑒定純度,在分光光度計上讀出A260、A280(光密度值D

A260/A280可判斷樣品的純度,純DNA>1.8、純RNA>2.0

 

三、核酸的變性與復(fù)性 分子雜交

(一)核酸的變性

1、核酸的變性的概念

指核酸的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂,變成單鏈,并不涉及共價鍵的斷裂,分子量不變,一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。

2、變性因素:加熱、酸堿度改變、有機溶劑、酰胺、尿素等。

3、變性表現(xiàn):增色效應(yīng);雙螺旋解體,形成無規(guī)則線團,粘度下降,浮力密度升高;部分或全部失去生物活性。

見圖

4、解鏈溫度Tm

通常把DNA的變性達到50%,即增色效應(yīng)達到一半時的溫度稱為該DNA的解鏈溫度。

DNA的熱變性一般在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生,就像固體結(jié)晶物質(zhì)在熔點突然熔化的情形一樣,所以常將熱變性稱為“溶解”;而將熱變性溫度稱為“熔點”或“解鏈溫度”,以Tm表示,或以T1/2表示,意為DNA失去一半雙螺旋時的溫度。DNATm值在8295之間。

核酸分子中一般以GC堿基對較AT堿基對穩(wěn)定,故富含GC堿基對的DNATm值相對高,因此測定Tm值可以粗略推算堿基對的含量。

見圖

(二)DNA的復(fù)性

變性DNA在適當(dāng)條件下,又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成為雙螺旋,這個過程叫DNA的復(fù)性。

復(fù)性表現(xiàn):許多理化性質(zhì)可恢復(fù),生物活性得以部分恢復(fù)。但是條件較復(fù)雜:

1、熱變性的DNA驟然冷卻不可能復(fù)性,緩慢冷卻時可復(fù)性。(退火:通常將因溫度升高引起DNA變性,而后變性DNA隨降溫而復(fù)性的過程)

2、DNA大小。DNA片段越大,復(fù)性越慢。 因為太大片段在介質(zhì)中由于擴散的問題, 尋找互補鏈機會大大減少,往往不能準確和快速的重新結(jié)合。

3DNA濃度。DNA濃度越大,復(fù)性越快。因為兩條互補鏈彼此相遇的可能性越大, 復(fù)性速度會越快。

4、離子強度。增加鹽濃度,兩條互補鏈重新結(jié)合的速度加快,因為鹽能中和兩條單鏈中的磷酸基團的負電荷,減少負電荷的互補單鏈的相互排斥。

見圖

(三)分子雜交(hybridization)

兩條來源不同但有核苷酸互補關(guān)系的DNA單鏈分子,或DNA單鏈分子與RNA分子,在去掉變性條件后互補的區(qū)段能夠退火復(fù)性形成雙鏈DNA分子和DNA/RNA異質(zhì)分子。

基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì),使來源不同的DNA(RNA)片段,按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNADNA鏈之間,也可在RNADNA鏈之間形成。

雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復(fù)性(加熱或堿處理)使雙螺旋解開成為單鏈,因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個環(huán)節(jié)。

應(yīng)用:鑒定核酸分子之間的同源性,在分子生物學(xué),分子遺傳學(xué)中應(yīng)用廣泛。

若雜交的目的是識別靶DNA中的特異核苷酸序列,這需要牽涉到另一項核酸操作的基本技術(shù)─探針(probe)的制備。

“探針”(Probe)新技術(shù):探針是指帶有某些標記物(如放射性同位素32P,熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。

若我們設(shè)法使一個核酸序列帶上32P,那么它與靶序列互補形成的雜交雙鏈,就會帶有放射性。以適當(dāng)方法接受來自雜交鏈的放射信號,即可對靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別。在現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗中,探針的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術(shù)手段。核酸分子雜交作為一項基本技術(shù),已應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的各個方面。在醫(yī)學(xué)上,目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷(gene diagnosis),惡性腫瘤的基因分析,傳染病病原體的檢測等領(lǐng)域中,其成果大大促進了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步和發(fā)展。

將另需待測DNA經(jīng)變性后,與探針一起保溫,發(fā)生雜交,如能雜和成雙鏈,則二者有同源性,堿基互補。應(yīng)用遺傳病診斷。

 

四、核酸的分離提純

自學(xué),關(guān)于核酸分離,純化的方法不只一種,而且專業(yè)性較強,

并因提取材料各異,詳細請參考實驗指導(dǎo)書。

第五節(jié)   核蛋白

核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成為核酸-----蛋白質(zhì)復(fù)合物,稱為核蛋白。

一、核糖體

又叫核糖核蛋白體,核蛋白體,由蛋白質(zhì)和rRNA組成。

二、病毒

是細胞內(nèi)寄生物,雖有蛋白質(zhì)和核酸,但是不具備生活細胞所必需的能量生成代謝和蛋白質(zhì)合成功能,本身不能繁殖,能引起多種疾病。只含有一種核酸(DNARNA)。

三、核小體    

由真核細胞的DNA與組蛋白結(jié)合成的核蛋白。

組蛋白是堿性蛋白,富含Arg Lys,約1/4。分為五類:H1H2a、H2bH3、H4

一系列的核小體重復(fù)單位組成染色質(zhì)絲,染色質(zhì)折疊成染色體。

核小體由H2a、H2b、H3、H4各兩分子組成的八聚體和DNA160240個堿基對構(gòu)成。140DNA堿基對繞組蛋白八聚體外圍盤繞1.75圈,剩余DNA連接在相鄰核小體核心之間,組蛋白H1結(jié)合其上,看起來似一串珠子。

 

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