NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶I）及其還原形式NADH是細(xì)胞內(nèi)參與能量代謝的重要氧化還原輔酶，在氧化還原反應(yīng)中，NADH和NAD+可分別作為氫和電子的供體和受體，調(diào)節(jié)呼吸作用、光合作用、酒精代謝等生理過程，并能夠相互轉(zhuǎn)化。細(xì)胞內(nèi)NADH:NAD+比值升高（即“還原性應(yīng)激”）會引起線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)功能障礙等病理反應(yīng)，維持適當(dāng)?shù)腘ADH:NAD+比例對包括能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞死亡和增殖等在內(nèi)的許多胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝過程至關(guān)重要【1,2】。因此，以NADH:NAD+為靶標(biāo)，開發(fā)新的治療氧化還原失調(diào)相關(guān)疾病的藥物，是目前制藥行業(yè)面臨的一個挑戰(zhàn)。近日，美國科學(xué)院院士、HHMI研究員、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授Vamsi K. Mootha?（2004年麥克阿瑟天才獎得主）團(tuán)隊(duì)在?Nature Biotechnology雜志發(fā)表了題為“An engineered enzyme that targets circulating lactate to alleviate intracellular NADH:NAD+ imbalance” 的Letter文章，作者開發(fā)了一種新的工程酶LOXCAT，該工程酶能通過直接控制胞外乳酸-丙酮酸平衡來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NADH:NAD+比例，以此緩解生物體內(nèi)的氧化還原失衡。
為開發(fā)新的針對細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡的治療策略，作者提出可以直接靶向與胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)偶聯(lián)的可滲透血液代謝物，以此間接調(diào)節(jié)組織氧化還原穩(wěn)態(tài)。作為NADH:NAD+比例的主要決定因素，乳酸脫氫酶（LDH，lactate dehydrogenase）在催化NADH氧化為NAD+的同時，能夠?qū)蓚€電子從NADH轉(zhuǎn)移到丙酮酸生成乳酸，細(xì)胞內(nèi)NADH:NAD+比值與循環(huán)乳酸:丙酮酸比值接近平衡【3】。作者因此推測，通過將細(xì)胞外乳酸氧化為丙酮酸，可以緩解還原性應(yīng)激。為驗(yàn)證該假說，作者設(shè)計(jì)了一種細(xì)菌乳酸氧化酶(LOX)和過氧化氫酶(CAT)的融合物——LOXCAT，它能不可逆地把乳酸和氧氣轉(zhuǎn)化為丙酮酸和水。將純化的LOXCAT加入到電子傳遞鏈缺陷型細(xì)胞中，可以顯著降低細(xì)胞外乳酸:丙酮酸比值，細(xì)胞內(nèi)NADH:NAD+比例也能恢復(fù)正常，且不會產(chǎn)生有害的代謝副產(chǎn)物。外源性丙酮酸鈉療法雖然可以通過非酶促氧化脫羧反應(yīng)清除H2O2，但會進(jìn)一步增加線粒體功能障礙發(fā)生時的乳酸負(fù)擔(dān)【4】，而LOXCAT的優(yōu)越性體現(xiàn)為其在維持細(xì)胞外丙酮酸水平的同時，并不會伴隨乳酸濃度的升高。此外，LOXCAT能夠通過上調(diào)NADH:NAD+比例來促進(jìn)3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的反應(yīng)，促進(jìn)ETC功能障礙細(xì)胞中糖酵解過程，并能恢復(fù)線粒體功能障礙病人的成纖維細(xì)胞增殖。隨后，作者在小鼠中驗(yàn)證了LOXCAT是否在體內(nèi)條件下同樣具有緩解氧化還原失衡的功能。首先，作者發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射LOXCAT能夠降低小鼠體內(nèi)循環(huán)乳酸:丙酮酸比值，但該酶在體內(nèi)的半衰期較短。作者將白蛋白結(jié)合肽(albumin-binding peptide，ABP)融合到LOXCAT的N端構(gòu)建了ABP-LOXCAT，在保證酶活性的前提下，提高了LOXCAT的半衰期。二甲雙胍（metformin）是一種線粒體復(fù)合物I抑制劑，處理小鼠會導(dǎo)致急性線粒體功能障礙。作者發(fā)現(xiàn)ABP-LOXCAT能夠有效減弱這種由二甲雙胍引起的心臟和大腦內(nèi)NADH:NAD+比例的升高，維持了心臟和大腦的氧化還原反應(yīng)平衡。簡而言之，作者在本研究中開發(fā)了一種新的工程酶LOXCAT，LOXCAT能通過直接控制細(xì)胞外乳酸和丙酮酸水平來緩解細(xì)胞和組織內(nèi)氧化還原失衡。雖然之前研究中已普遍將循環(huán)乳酸:丙酮酸比值作為組織氧化還原狀態(tài)的標(biāo)志性指標(biāo)，但本研究進(jìn)一步證明該指標(biāo)同樣是一種效應(yīng)物，即直接操縱循環(huán)乳酸:丙酮酸比值可以恢復(fù)心臟和大腦等器官的NADH:NAD+平衡。本研究為通過靶向氧化還原偶聯(lián)代謝物最終緩解胞內(nèi)氧化還原失衡的工程酶注射療法奠定了基礎(chǔ)。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41587-019-0377-71. Vafai, S. B. & Mootha, V. K. Mitochondrialdisorders as windows into an ancient organelle. Nature 491, 374–383 (2012).2. Thompson Legault, J. et al. A metabolic signatureof mitochondrial dysfunction revealed through a monogenic form of Leighsyndrome. Cell Rep. 13, 981–989 (2015).3. Tilton, W. M., Seaman, C., Carriero, D. &Piomelli, S. Regulation of glycolysis in the erythrocyte: role of thelactate/pyruvate and NAD/NADH ratios. J. Lab.Clin. Med. 118, 146–152 (1991).4. Fujii, T. et al. Efficacy of pyruvate therapy inpatients with mitochondrial disease: a semi-quantitative clinical evaluationstudy. Mol. Genet. Metab. 112, 133–138 (2014).
