小編不想背負(fù)這樣的評(píng)價(jià)，也不敢怠慢，因此為了彌補(bǔ)前篇的愧疚感，趕緊把關(guān)鍵知識(shí)補(bǔ)上，來(lái)減輕下內(nèi)心的不安。
其時(shí)為什么上篇寫了那么多，其時(shí)只想讓大家對(duì)內(nèi)毒素有個(gè)全面的了解，對(duì)內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的危害有了大致的了解，這樣才能更好的展開(kāi)，因?yàn)樯镏破返淖罱K使用者不是動(dòng)物就是人類，內(nèi)毒素在生物制品中的含量直接影響到了生物制品的質(zhì)量及使用效果，因此多費(fèi)些口舌，進(jìn)行了敘述，“文不對(duì)題”并不是小編的本意。
好了，閑話少說(shuō)，直入主題。
一、生物制品中的內(nèi)毒素來(lái)源
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng)或死亡裂解后產(chǎn)生的一種脂多糖類物質(zhì)。那么存在革蘭氏陰性細(xì)菌的地方，就有可能存在內(nèi)毒素。
大家知道，空氣中含量大量的細(xì)菌，你每吸一口空氣，就會(huì)有大量的細(xì)菌通過(guò)呼吸道進(jìn)行你的身體內(nèi)，只是體內(nèi)存在大量的相關(guān)抗體可以消滅相關(guān)細(xì)菌，所以一般情況下你不會(huì)生病。
對(duì)于生物制品的生產(chǎn)，對(duì)每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的嚴(yán)格把控是控制內(nèi)毒素的關(guān)鍵所在。那么生物制品中內(nèi)毒素究竟來(lái)源于哪里?
1、菌種毒
細(xì)菌類制品或以某些細(xì)菌如大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)的重組制品（如現(xiàn)在豬用的圓環(huán)亞單位疫苗，部分廠家就是使用的大腸桿菌進(jìn)行PCV2圓環(huán)病毒的Cap蛋白的大量表達(dá)，然后重組成病毒顆粒），因其表達(dá)多為胞內(nèi)表達(dá)，在破碎菌體時(shí)，大量的內(nèi)毒素釋放出來(lái)，如果相關(guān)生物制品沒(méi)有進(jìn)行過(guò)高純度的純化，就會(huì)嚴(yán)重影響生物制品的質(zhì)量及使用效果。因此，菌種或種用細(xì)胞在入庫(kù)前需要進(jìn)行嚴(yán)格的內(nèi)毒素檢測(cè)。
2、生產(chǎn)環(huán)境
藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范—GMP(Good Manufacturing Practice)要求生物制品生產(chǎn)必須在符合其要求的潔凈廠房?jī)?nèi)生產(chǎn)，如細(xì)菌培養(yǎng)或半成品配制及分裝需要在100級(jí)潔凈區(qū)進(jìn)行，純化應(yīng)在十萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)進(jìn)行，當(dāng)然部分生產(chǎn)企業(yè)為了節(jié)省建造成本，會(huì)在的大空間的生產(chǎn)區(qū)域內(nèi)建立隔離小區(qū)，小區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)可以達(dá)到進(jìn)行某些生產(chǎn)操作的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。在這個(gè)過(guò)程中，如果達(dá)不到以上潔凈環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，有很大可能會(huì)造成內(nèi)毒素污染，或生產(chǎn)出的產(chǎn)品內(nèi)毒素超標(biāo)，導(dǎo)致前期生產(chǎn)成本與時(shí)間的浪費(fèi)，給企業(yè)運(yùn)營(yíng)效率帶來(lái)大的影響。
關(guān)于空氣潔凈度，其是指潔凈環(huán)境中空氣含懸浮粒子量多少的程度，通?？諝庵泻瑝m濃度低則空氣潔凈度高；含塵濃度高則空氣潔凈度低。關(guān)于空氣潔凈度的標(biāo)準(zhǔn)每個(gè)國(guó)家均有自己國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)。下圖是中國(guó)及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的比較表：
注：1、由于涉及測(cè)量過(guò)程的不確定性，故要求用不超過(guò)三個(gè)有效的濃度數(shù)字來(lái)確定等級(jí)水平
2、 PC(permissible concentration):容許濃度值。
關(guān)于藥品生產(chǎn)車間潔凈度的要求標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下表：
3、不規(guī)范操作
操作人員進(jìn)出車間、更衣、洗手、消毒及無(wú)菌操作不規(guī)范均可能造成內(nèi)毒素污染。因此在生產(chǎn)環(huán)節(jié)，任何一個(gè)細(xì)節(jié)都必須有嚴(yán)格的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，否則一旦由于相關(guān)操作不規(guī)范導(dǎo)致生產(chǎn)的產(chǎn)品內(nèi)毒素含量超標(biāo)，最后影響的不僅僅是產(chǎn)品的品牌，更會(huì)影響公司的形象及品牌，尤其是在互聯(lián)網(wǎng)盛行的當(dāng)下，任何負(fù)面新聞報(bào)道，都會(huì)對(duì)一個(gè)企業(yè)造成巨大的影響，比如最近曝光的虐童事件對(duì)攜程和紅藍(lán)黃公司的影響(不過(guò)劇情措不及防發(fā)生反轉(zhuǎn)了，感覺(jué)寶寶不是活在了新聞連播里，現(xiàn)在是活在了狗血?jiǎng)∏榈碾娪爸?。
4、設(shè)備及器械
生物制品生產(chǎn)過(guò)程中的所有接觸制品的設(shè)備、容器、管道、濾膜、介質(zhì)等未按正確的方法進(jìn)行消毒滅菌，均會(huì)造成內(nèi)毒素的污染。
5、原輔材料
生產(chǎn)過(guò)程中直接與制品接觸的注射用水、各種化學(xué)試劑、添加劑、保護(hù)劑等其本身均含有內(nèi)毒素，這也是生物制品內(nèi)毒素污染的最主要原因，這也是生物制品企業(yè)的質(zhì)檢部門的部分職責(zé)所有，就是要通過(guò)使用前的檢測(cè)對(duì)原輔材料可能存在的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，保證從源頭上沒(méi)有相關(guān)因素來(lái)影響產(chǎn)成品的質(zhì)量。而在我看來(lái)，這也是有效控制內(nèi)毒素污染成本最低，效率最高的方法。在上篇文章中已經(jīng)講述過(guò)內(nèi)毒素的檢測(cè)及檢測(cè)原理，至于相關(guān)的檢測(cè)步驟，如果大家有興趣，可以找Google或是度娘。
講完了來(lái)源，那么我們?nèi)绾慰刂苾?nèi)毒素的污染呢，下面就是控制方法。
二、 生產(chǎn)過(guò)程中內(nèi)毒素污染的控制
對(duì)于生產(chǎn)制品生產(chǎn)過(guò)程中內(nèi)毒素含量多少或污染的控制關(guān)鍵的措施在于生產(chǎn)過(guò)程的嚴(yán)格控制，即嚴(yán)格按照GMP要求進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止內(nèi)毒素超標(biāo)或污染。
1、生產(chǎn)車間
上面已經(jīng)提出了潔凈室或潔凈區(qū)的國(guó)家要求標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于生物制品生產(chǎn)車間必須嚴(yán)格符合GMP要求的潔凈度，按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行嚴(yán)格消毒，潔凈區(qū)每天進(jìn)行小清消，百級(jí)和萬(wàn)級(jí)區(qū)間每周至少進(jìn)行一次大清消，而對(duì)于十萬(wàn)級(jí)的區(qū)間每月至少進(jìn)行一次大清消。除了定時(shí)定次的清消外，由于季節(jié)變化、溫度、濕度的變化，潔凈度也會(huì)發(fā)生變化，因此要定期對(duì)潔凈室或潔凈區(qū)進(jìn)行沉降菌、擦拭菌和塵埃粒數(shù)的檢測(cè)，這樣才能保證生產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)年符合GMP文件的生產(chǎn)要求，達(dá)成合格標(biāo)準(zhǔn)。定期清消對(duì)于一些生物制品企業(yè)來(lái)說(shuō)不是難事，可定期對(duì)生產(chǎn)區(qū)間的潔凈室或潔凈區(qū)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，可能很多企業(yè)做不到，這也會(huì)導(dǎo)致不同批次的產(chǎn)品中，內(nèi)毒素含量的不同，甚至內(nèi)毒素的污染。
在生產(chǎn)制品過(guò)程中，由于不同的生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)易污染程度的不同，導(dǎo)致不同的生產(chǎn)操作需要在不同的區(qū)間進(jìn)行，比如，發(fā)酵與粗純應(yīng)在十萬(wàn)級(jí)區(qū)間進(jìn)行，精純需要在萬(wàn)級(jí)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)、除菌、分裝等必須在百級(jí)區(qū)進(jìn)行。
2、設(shè)備用具
細(xì)菌內(nèi)毒素的組成成分在上篇文章中已經(jīng)提到，其主要活性成分為脂多糖(LPS)，而脂多糖很容易吸附在容器上，生產(chǎn)過(guò)程中任何直接接觸制品的設(shè)備、容器、生產(chǎn)用具、管路等必須保證無(wú)熱原（熱原：指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使機(jī)體發(fā)熱的物質(zhì)）。耐熱器具如玻璃、不銹鋼等就進(jìn)行干熱滅菌（因?yàn)樯掀姓f(shuō)到，內(nèi)毒素對(duì)熱的耐受性比較強(qiáng)，濕熱滅菌法不能破壞內(nèi)毒素）；而不耐熱用具如膠塞、膠管等，可采用0.2M氫氧化鈉或鹽酸浸泡4h以上，如果急用這些用具，可采用熱加化學(xué)的方式，在酸或堿中煮沸30min，然后用新鮮注射用水沖洗至中性，再高壓滅菌（可節(jié)省至少2h時(shí)間）。而對(duì)于培養(yǎng)罐、泵、管道、閥門、濾器、層析柱等應(yīng)進(jìn)行原位清洗，一般用酸或堿水高溫清洗后，用注射用水清洗至中性，有的還會(huì)再用高壓蒸汽進(jìn)行消毒，以進(jìn)一步保證整個(gè)生產(chǎn)用具的清潔無(wú)菌。
3、原輔材料
保證注射用水新鮮無(wú)熱源（當(dāng)然，我們這里只講到了內(nèi)毒素，其時(shí)生產(chǎn)用水在正式使用前，還要很多檢測(cè)項(xiàng)目要進(jìn)行，比如離子度、PH值等，比如PH值偏高偏低會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，進(jìn)而影響后期病毒的繁殖）?；瘜W(xué)原料應(yīng)盡量選購(gòu)無(wú)熱原的，這里建議通過(guò)比較，確定原料供應(yīng)商后，沒(méi)有大的事故發(fā)生，一定要保證供應(yīng)商的穩(wěn)定。如不能保證無(wú)熱原，應(yīng)將試劑按配制量稱量后放在容器內(nèi)進(jìn)行干熱滅菌后加入無(wú)熱原注射用水配制液體，然后進(jìn)行蒸汽滅菌后再使用。生物制品常用的化學(xué)試劑如NaCl、KBr等均可干熱滅菌。
4、無(wú)菌操作
無(wú)菌操作的關(guān)鍵是操作者必須嚴(yán)格按SOP更衣、洗手、消毒。對(duì)于任何非封閉系統(tǒng)的操作，均應(yīng)采取無(wú)菌操作方式。如離心、層析進(jìn)出樣及超濾操作時(shí)就注意對(duì)容器口的保護(hù)，不可裸手接觸管道，操作時(shí)最好戴無(wú)菌手套并隨時(shí)消毒雙手和工作區(qū)域。每步純化收集的樣品應(yīng)立即冷藏，不可在室溫放置過(guò)久。
這里要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)，現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成熟，可部分企業(yè)的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)線只是拿來(lái)宣傳的，生產(chǎn)出的制品仍然是采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶法，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。那么懸浮培養(yǎng)除了大家常知道的最大優(yōu)點(diǎn)—可以提高培養(yǎng)病毒的濃度，也就是疫苗中的抗原含量外，還有一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)就是，由于其不需要細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶式的病毒收集，和外界接觸的機(jī)率減少，大大減少了內(nèi)毒素污染的可能，產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量更低，產(chǎn)品質(zhì)量更安全，更可靠。
寫到這里，小編發(fā)現(xiàn)自己高估自己的預(yù)測(cè)能力了，本來(lái)以為，這篇文章可以將關(guān)于生物制品中內(nèi)毒素的相關(guān)知識(shí)補(bǔ)充完整，可結(jié)果是洋洋灑灑寫了3000多字，竟然還沒(méi)有寫完，考慮到文章太長(zhǎng)，大家讀起來(lái)費(fèi)力又沒(méi)有耐心，加之后面要寫的“如何去除內(nèi)毒素”相關(guān)內(nèi)容與生命科學(xué)息息相關(guān)，一些儀器的原理等要進(jìn)行更全面的展開(kāi)，小編只能就此擱筆吧，這次不管你說(shuō)我欺騙感情也好，還是不切中主題也罷，小編耐心接受，但小編的目的只有一個(gè)，要講就盡量將相關(guān)內(nèi)容講透。如果您還期待后面一篇，那么請(qǐng)繼續(xù)保持您的耐心…………
備注：第一次試著用秀米進(jìn)行排版，不是很雅觀，還請(qǐng)各位看觀見(jiàn)涼！
想要了解同內(nèi)毒素的基本知識(shí)請(qǐng)查閱：你真得了解細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)生物制品的危害嗎？(上）
聯(lián)系客服
