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卒中是全球最主要的致死性疾病之一,也是目前中國第一位的死亡病因[1-2]?其中,腦動脈狹窄或栓塞引起的卒中是最常見的卒中類型,其因快速且不可逆的缺血缺氧性組織壞死而產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀[3]?腦血運重建是缺血性卒中的首要治療目標(biāo),但其治療方法非常有限,針對責(zé)任血管的藥物溶栓或介入治療雖有實現(xiàn)血管再通的可能,但因治療時間窗短?再通成功率不高等原因而只能使部分卒中患者獲益[4]?因此,促進梗死周圍區(qū)的腦側(cè)支血管生成,間接恢復(fù)缺血區(qū)血流,對于缺血性卒中的治療及預(yù)后意義重大?

缺血性卒中后機體啟動代償保護機制,利用側(cè)支循環(huán)恢復(fù)缺血區(qū)血流?其中,初級代償通路是連接大腦前后血流的大腦底部吻合動脈環(huán)——Willis環(huán),而大腦動脈皮質(zhì)支在軟腦膜內(nèi)形成的血管網(wǎng)與連接頸內(nèi)?外動脈的眼動脈組成次級代償通路共同發(fā)揮作用[5]?當(dāng)這兩條代償途徑受到先天發(fā)育及后天致病因素的影響,缺乏足夠的代償能力時,新生血管就成為了最后的代償途徑?研究表明,梗死周圍區(qū)的微血管密度,與卒中患者的存活時間延長相關(guān)[6]?腦側(cè)支血管生成是在供血動脈閉塞或嚴(yán)重狹窄條件下,由腦缺血區(qū)現(xiàn)存血管萌生或者分裂而形成新的微血管網(wǎng)的過程,除多種血管生長因子直接誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮反應(yīng)外,還包含基底膜的降解?血管網(wǎng)的剪切以及血管周圍基質(zhì)細胞(周細胞)的支持穩(wěn)定等多種復(fù)雜的生理?病理活動[7]?側(cè)支血管生成不僅是病理條件下新血管生成的始動環(huán)節(jié),也是多種細胞信號通路共同調(diào)控的核心階段?

VEGF因其對血管內(nèi)皮細胞具有高度特異性的促有絲分裂作用,目前被認(rèn)為是最關(guān)鍵的血管生成介導(dǎo)因子[8]?多種VEGF配體中,VEGFA在腦血管生成過程中發(fā)揮作用[9]?VEGFR 根據(jù)是否具有酪氨酸激酶活性分為VEGFR-1?VEGFR-2?VEGFR-3以及神經(jīng)纖毛蛋白1?神經(jīng)纖毛蛋白2[10]?當(dāng)腦組織缺血缺氧發(fā)生后,低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor1,HIF-1)首先激活 VEGF-VEGFR 通路,VEGF與其酪氨酸激酶受體VEGFR-2相結(jié)合,通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的酪氨酸激酶反應(yīng),誘導(dǎo)一系列生理?病理活動,包括改變血管內(nèi)皮細胞的功能狀態(tài),促進其增殖?遷移;刺激前列環(huán)素和一氧化氮(nitric oxide,NO)的產(chǎn)生,舒張血管,增加血管通透性;通過趨化作用使巨噬細胞聚集并進一步分泌VEGF等細胞因子;增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的生成,分解細胞外基質(zhì)以及抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡等[11]?VEGFR-1與VEGF親和力高,但酪氨酸激酶活性低,因此可以競爭性抑制VEGF與VEGFR-2的結(jié)合,負性調(diào)控血管的生成[12]?

研究顯示,在小鼠大腦中動脈閉塞(middlecerebral artery occlusion, MCAO)1 d后,VEGFR-1?VEGFR-2在梗死周圍區(qū)表達均增加,3 d 后水平最高,7 d后逐漸恢復(fù)正常;而VEGF的表達水平較上述兩種受體更早發(fā)生上調(diào),約2 周后開始下降[13]?缺血性卒中早期,特別是最初 1 h,單獨給予VEGF治療有加重腦水腫的風(fēng)險,這可能與腦血管通透性增加有關(guān),而腦缺血再灌注發(fā)生后24 ~ 72 h給藥表現(xiàn)出更有益于血管生成與神經(jīng)功能恢復(fù)的結(jié)果[10]?

NO是生物體內(nèi)一種重要的信號分子與生物自由基,產(chǎn)生于包括腦組織在內(nèi)的多種組織中[14]?在脈管系統(tǒng)中,NO 主要由內(nèi)皮型 NO 合成酶催化產(chǎn)生,內(nèi)皮型 NO合成酶首先在相關(guān)蛋白激酶的作用下激活,而后進一步氧化L-精氨酸產(chǎn)生NO[15]?另外,NO作為激活因子可以活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,使三磷酸鳥苷迅速完成向cGMP的轉(zhuǎn)化,進而通過激活蛋白激酶G 促進下游信號的傳導(dǎo)[16]?NO-cGMP通路可以刺激細胞內(nèi)Ca2 +濃度下降從而松弛平滑肌細胞,并改變其細胞骨架,促進血管的擴張和通透性增加[17]?

缺血性卒中發(fā)生后,NO-cGMP通路介導(dǎo)的血管通透性增加促使血漿蛋白滲出,為血管內(nèi)皮細胞的遷移提供了移動媒介?此外,NO和cGMP的生成能夠促進VEGF等血管生長因子的的血管生成活性,以及誘導(dǎo)血管外基質(zhì)的重塑[18]?因此,NO-cGMP通路被認(rèn)為是腦側(cè)支血管生成過程中的早期通路?在大鼠MCAO 24 h 內(nèi),特別是最初 1 ~ 2 h,內(nèi)皮型NO合成酶產(chǎn)生的 NO能夠改善梗死周圍區(qū)內(nèi)的腦血流量,減少梗死體積[19]?而在大鼠缺血再灌注模型中,給予5 型磷酸二酯酶抑制劑可以抑制cGMP的水解,增加缺血區(qū)腦血流量并改善神經(jīng)功能[20]?

典型的 Notch 信號通路由其配體Jagged1?Jagged2?Delta-like1?Delta-like3?Delta-like4以及受體Notch1?Notch2?Notch3?Notch4 及CSL-DNA 結(jié)合蛋白和靶基因組成[21]?當(dāng)同樣作為Ⅰ 型跨膜蛋白的Notch配體?受體結(jié)合后,受體蛋白經(jīng)過γ-分泌酶復(fù)合物以及去整合素-金屬蛋白酶的數(shù)次剪切后釋放胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域進一步轉(zhuǎn)移至細胞核并與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合,共同激活下游靶基因,改變細胞功能[22]?Notch信號通路主要介導(dǎo)的是細胞間的信傳遞,是通過相鄰細胞的相互作用來調(diào)控細胞的生理過程[23]?

研究顯示,由配體Delta-like4與Notch受體結(jié)合形成的 DLL4-Notch 通路在腦側(cè)支血管生成過程中與VEGF-VEGFR通路協(xié)同發(fā)揮作用[24]?當(dāng)VEGFA水平上升時,部分內(nèi)皮細胞根據(jù)位置的不同,分別分化為尖端細胞和軀干細胞,尖端細胞以絲狀突起的形式向細胞外基質(zhì)延伸,促進血管出芽[25]?同時,VEGFA誘導(dǎo)尖端細胞合成Delta-like4,激活相鄰軀干細胞中的 Notch信號,使其進一步活化,誘導(dǎo)新生血管的萌出或分裂,協(xié)助 VEGF-VEGFR通路促進管腔及血管網(wǎng)絡(luò)的形成[26]?此外,配體Jagged1 及其受體Notch1在人腦梗死灶周圍區(qū)域大量增加,而小鼠MCAO模型中,慢病毒介導(dǎo)的 Notch1敲除可以減少腦缺血誘導(dǎo)的側(cè)支血管生成[27]?

Ang是對血管發(fā)育及成熟具有重要作用的生長因子[28]?其中,Ang-1主要在血管周細胞中表達,以多聚體的形式作用于血管內(nèi)皮細胞和周細胞中具有表皮生長因子同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶受體Tie2[29]?結(jié)合Ang-1后,Tie2會啟動自身磷酸化,并進一步激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylineosi-tol-3kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)等信號通路,促進內(nèi)皮細胞及周細胞的增殖與遷移,共同維持脈管系統(tǒng)的穩(wěn)定[30]?Ang-2 與Tie2 的結(jié)合活性低于Ang-1,但可一定程度上抑制Ang-1與Tie2的結(jié)合,在VEGF分泌不足時,Ang-2 可誘導(dǎo)血管的損傷[31]?因此,Ang-1?Ang-2 的表達水平以及與Tie2受體的結(jié)合情況對血管的生成與穩(wěn)定具有重要作用?

急性缺血發(fā)生后,由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及某些調(diào)節(jié)因子(如Src家族酪氨酸激酶)的作用,Ang2的活化數(shù)量明顯增加,而Ang-1和Tie2相對缺乏,從而導(dǎo)致Ang-1與Ang-2的比例平衡遭到破壞,血液定量分析結(jié)果表明,Ang-2?Tie2 的表達水平與腦缺血的嚴(yán)重程度有關(guān);隨著缺血性卒中的進展,特別是再灌注發(fā)生后,缺氧環(huán)境和VEGF等生長因子可激活和聚集Tie2,Ang-Tie2通路被激活,進而刺激血管內(nèi)皮細胞和周細胞的活動性增加[32]?此外,活化的內(nèi)皮細胞可以分泌血小板衍生生長因子BB并作用于周細胞質(zhì)膜上的相應(yīng)受體,進一步募集周細胞[33]?與VEGF-VEGFR通路側(cè)重于調(diào)控血管的萌出與生長不同,Ang-Tie2通路的作用更多表現(xiàn)在促進新生血管的成熟與穩(wěn)定?

Akt是一種絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K的下游因子,兩者組成的通路是細胞內(nèi)的重要信號通道,主要介導(dǎo)細胞活化?增殖?凋亡等活動[34]?在酪氨酸激酶受體或部分細胞因子受體經(jīng)配體結(jié)合激活后,胞內(nèi)的 PI3K經(jīng)誘導(dǎo)向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,與4,5-二磷酸磷酯酰肌醇結(jié)合促使其磷酸化,轉(zhuǎn)化為1,4,5-三磷酸磷酯酰肌醇,進一步結(jié)合Akt后,通過誘導(dǎo)下游信號途徑的磷酸化,參與調(diào)控細胞功能[35]?其中,雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作為許多信號途徑中的效應(yīng)分子,同樣是該通路一個重要的下游靶點蛋白[36]?

腦側(cè)支血管生成過程中,參與激活 VEGF-VEGFR通路的 HIF-1是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄蛋白,腦組織缺血缺氧發(fā)生后,其亞基HIF-1α的表達水平迅速升高,在8 ~ 24 h內(nèi)達到峰值,最終恢復(fù)到正常水平[37]?PI3K-Akt-mTOR信號通路可以作用于HIF-1α,使其與細胞核中轉(zhuǎn)運蛋白HIF-1β相結(jié)合,并激活低氧反應(yīng)相關(guān)基因,促進VEGF等血管生長因子的表達[38]?在氧糖剝奪離體人腦微血管內(nèi)皮細胞中,PI3K-Akt-mTOR通路的激活可以誘導(dǎo)細胞的活化與遷移,給予通道抑制劑LY294002 可以消除這種作用[39]?此外,PI3K-Akt 通路能夠調(diào)節(jié) NO 信號通路,促進NO從血管內(nèi)皮細胞中釋放,發(fā)揮促血管生成的作用[40]?

miRNA是一類非編碼單鏈RNA小分子,能夠與靶基因信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)非翻譯區(qū)結(jié)合,促使其mRNA降解或翻譯阻滯,負性調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達[41]?基于miRNA的治療藥物包括模擬miRNA 前體的雙鏈寡聚核苷酸?與miRNA高度互補的單鏈反義寡聚核苷酸以及通過調(diào)節(jié)miRNA功能而發(fā)揮神經(jīng)保護作用的部分藥物[42]?

研究表明,miR-107?miR-210?miR-376b-5p?miR-140-5p等幾種miRNA 對腦側(cè)支血管生成起重要作用[43]?大鼠MCAO 后,HIF-1 刺激腦內(nèi)miR-107水平上升,miR-107通過上調(diào) VEGF的表達促進側(cè)支血管生成,使用miR-107 抑制劑可以減少梗死周圍區(qū)的微血管數(shù)量[44]?缺血性卒中后,miR-210轉(zhuǎn)錄增加,miR-210 通過上調(diào) VEGF 水平和激活Notch信號通路,促進微血管網(wǎng)的形成[45]?而在大鼠MCAO 模型中,miR-376b-5p 抑制了腦缺血后的側(cè)支腦血管生成,作用機制與抑制HIF-1 誘導(dǎo)的VEGFA增加以及VEGFA 對DLL4-Notch 通路的激活有關(guān)[46]?miR-140-5p 則直接作用于VEGFA mRNA的 3’非翻譯區(qū),抑制其轉(zhuǎn)錄后表達[47]?目前,尚無miRNA 藥物被應(yīng)用于臨床治療,但由細胞外囊泡構(gòu)建的內(nèi)源性遞送系統(tǒng)在動物實驗中取得了成功,或可以通過靜脈注射載有miR-210 的細胞外囊泡 RGD-exo 將miR-210 傳遞到缺血腦區(qū),誘導(dǎo)血管生成[48]?

干細胞移植的治療方法在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中正被廣泛研究,其在缺血性動物模型以及臨床試驗中表現(xiàn)出有益的作用,體現(xiàn)在神經(jīng)保護?神經(jīng)發(fā)生?血管生成?免疫調(diào)節(jié)以及抗炎作用等多個方面?

骨髓單核細胞移植可以調(diào)節(jié)局部或全身炎性反應(yīng),促進血管生成?神經(jīng)發(fā)生及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,其中,分化為內(nèi)皮細胞是其修復(fù)缺血性損傷的主要機制[49]?有臨床研究結(jié)果表明,缺血性卒中后盡早靜脈輸注自體骨髓單核細胞,有利于缺血性卒中患者神經(jīng)功能缺損癥狀的恢復(fù)[50]?骨髓間充質(zhì)干細胞除直接分化為內(nèi)皮細胞外,還可通過PI3K-Akt等信號通路增加VEGF 等血管生成因子的表達,促進腦側(cè)支血管的生成,再通過誘導(dǎo)周細胞?平滑肌細胞的增殖與遷移,進一步促進新生血生管網(wǎng)的成熟[40]?一項為期2 年的臨床研究納入了18 例缺血性卒中后6 ~ 60 個月存在慢性運動障礙的患者,平均分成3 個隊列,通過MRI 立體定位技術(shù)將一種異體修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞——SB623 細胞分別以2. 5 × 106 個?5. 0 × 106 個和10. 0 × 106 個3 種劑量單次注射到患者梗死區(qū),所有患者未出現(xiàn)死亡或遺留后遺癥,且完成24 個月治療的 16 例患者慢性運動障礙均得到改善[51]?培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植也是修復(fù)腦組織缺血性損傷的有效方法,神經(jīng)干細胞能夠提供VEGF 等治療性基因產(chǎn)物以促進腦側(cè)支血管生成,同時VEGF 可以進一步激活 PI3K-Akt 等通路進而改善神經(jīng)功能[52]?一項研究納入了23 例缺血性卒中后2 ~ 13 個月有明顯上肢運動缺陷的 40 歲以上患者,結(jié)果表明,腦內(nèi)植入人類神經(jīng)干細胞后12 個月的隨訪中未發(fā)生細胞相關(guān)不良事件,2 例死亡與試驗程序無關(guān);14 例患者上肢運動功能在移植后3?6 和12 個月隨訪時有所好轉(zhuǎn)[53]?此外,干細胞在充當(dāng)基因傳遞載體的同時,也分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子?在大鼠缺血性卒中模型中,移植過表達VEGF 等各種生長因子或細胞因子的基因修飾干細胞能顯著促進神經(jīng)功能恢復(fù)[49]?

在缺血性卒中急性期(發(fā)病1 周內(nèi)),與腦內(nèi)植入相比,靜脈或動脈注射干細胞規(guī)避了腦部手術(shù)風(fēng)險的同時還能夠提供更多的細胞數(shù)量,但存在肺?腦微血管栓塞的可能;而在慢性期(發(fā)病6 個月后),腦內(nèi)植入可能取得更好的效果,但侵入性治療帶來的損傷無法評估?此外,干細胞類型?細胞移植劑量以及患者的特異性都會影響治療效果[54]?

近年來,中草藥在治療部分疑難疾病中表現(xiàn)出新的活力?天麻素?葛根素?丹紅注射液等已經(jīng)成功應(yīng)用于缺血性卒中的臨床治療?此外,人參皂苷Rg1 作為人參的一種活性成分,可通過PI3K-Akt-mTOR 信號通路增加VEGF 的表達,促進缺血性卒中后的腦血管生成[39]?白藜蘆醇是植物中提取的一種非黃酮類多酚抗毒素,在缺血性動物模型中能夠激活 PI3K-Akt 等信號通路增加腦血流量,減小梗死體積[55]?梓醇是地黃的有效成分之一,能夠作用于HIF-1α-VEGF 通路,促進血管內(nèi)皮細胞增生,保護血管結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)側(cè)支血管生成[56]?XQ-1H 是由銀杏內(nèi)酯B 修飾得到的一種新合成化合物,近期研究中發(fā)現(xiàn)其通過PI3K-Akt 通路促進了腦缺血小鼠的腦血管生成,且該通路的特異性抑制劑可以阻斷此效應(yīng)[57]?

許多中草藥及其制劑在臨床前研究中表現(xiàn)出顯著的治療效果,但并未成功完成臨床轉(zhuǎn)化,這或與血-腦屏障的限制以及人體的吸收代謝等因素相關(guān)?利用細胞外囊泡?聚合物分子等納米載體材料將中草藥有效成分或單體輸送至缺血區(qū)域,可能更有利于實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用?加強中草藥有效成分及其配伍關(guān)系的研究,或?qū)⑹俏磥淼闹攸c?

腦側(cè)支血管生成是一個復(fù)雜的病理過程,在缺血性卒中的各個時期,均受到多種信號通路的協(xié)同調(diào)控?同時,多種血管生成因子?神經(jīng)遞質(zhì)以及胞內(nèi)的輔助蛋白?下游靶點蛋白也參與到信號的調(diào)節(jié)過程中?因此,從信號傳導(dǎo)的角度來分析其機制對發(fā)現(xiàn)新的治療靶點十分必要?目前,越來越多針對缺血性卒中的新療法被應(yīng)用到各種研究之中,顯現(xiàn)出了巨大的潛力?而不同治療方法之間的組合,如中草藥與外源性干細胞移植,以及與血管內(nèi)治療等方法的聯(lián)合應(yīng)用,可能會為腦側(cè)支血管生成以及缺血性卒中的治療帶來更多可能?