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盡管液體活檢中最為人熟知的就是外周血cfDNA分析，但這一概念事實上還包括從血液或其他體液中分離和分析腫瘤釋放物質（如DNA、RNA，甚至完整細胞）。利用專門的技術，可以從正常血細胞的背景中檢測和分離循環(huán)腫瘤細胞，進一步行分子分析，甚可在免疫抑制的小鼠中植入、培養(yǎng)這些細胞。此外，腫瘤細胞釋放的外泌體也包含腫瘤特異性蛋白質和核酸，包括游離RNA（比DNA穩(wěn)定性低）和cfDNA。血液不是唯一可用于液體活檢的體液。尿液、糞便、腦脊液（CSF）、唾液、胸腔和腹腔積液都是cfDNA的潛在來源，上述部位的cfDNA分析可能適用于特定癌癥類型。

圖1. 液體活檢方式總覽 

cfDNA是指在血液的非細胞成分中發(fā)現(xiàn)的片段化DNA，cfDNA在細胞凋亡或壞死后釋放到血液中，并通常以長度約為150-200個堿基對的鏈狀片段存在。cfDNA可從循環(huán)中快速清除，半衰期不足1小時。來自正常細胞的cfDNA在健康人的血漿中以低水平存在（平均約10-15 ng/ml），在組織應激條件下（運動，炎癥，手術或組織損傷）可出現(xiàn)升高。腫瘤患者的cfDNA總體水平高于非腫瘤患者，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）為整體cfDNA的一部分。不同個體中cfDNA中ctDNA的比例不盡相同，從不到0.1％到超過90％不等。ctDNA的比例趨于平行于個體的腫瘤負荷。由于腫瘤釋放的cfDNA的水平低，半衰期短，穩(wěn)定性低，且正常血細胞裂解也可能釋放一定量的cfDNA導致DNA污染，需要采血時將血漿離心并在1-4小時內分離。含有固定劑的專用cfDNA收集管可以穩(wěn)定cfDNA和完整細胞，保證其在室溫下儲存7至14天，便于運輸、存儲和集中處理。目前基于PCR分析的突變特異性技術——例如BEAMing或ddPCR——可識別cfDNA中等位基因頻率低至0.01％甚至更低的突變，NGS也適用于cfDNA檢測。但這些方法的靈敏度和特異性受到DNA聚合酶錯誤率和測序反應的限制。目前如何提高cfDNA檢測的精準度正在探索中。

圖2. cfDNA的提取和分析

無需組織活檢，，cfDNA分析讓無法取得標本或不能耐受取材的患者有機會進行檢測，并更大限度地讓長期檢測腫瘤DNA成為可能。其次，與單個病灶針吸活檢相比，cfDNA分析可以更好地捕獲患者腫瘤中多個不同克隆群體所具有的分子異質性。此外，cfDNA分析還可對臨床未能明確診斷的疾病進行腫瘤檢測和監(jiān)測。

通過簡單的抽血評估患者腫瘤的分子譜，而無需進行有創(chuàng)活檢，使得DNA分析對臨床醫(yī)生和患者極具吸引力，但是cfDNA分析與組織檢測的一致性為關鍵問題。早期小樣本量研究表明，腫瘤和血漿樣本中檢測到的DNA改變之間的一致性較低，但當時的研究血檢和組織活檢的取樣時間不同，檢測結果的差異可由腫瘤的分子進化而產(chǎn)生潛在差異解釋。此外，許多血樣未在最佳時機采血，部分患者采樣于治療開始后ctDNA水平處于最低水平，在cfDNA水平較低的患者中獲得真陽性或陰性結果的方式仍然是一項重要挑戰(zhàn)。后續(xù)更大樣本、更嚴謹?shù)脑囼灡砻?，同時獲得的血漿和組織樣本之間的一致率較高，特別是對于關鍵驅動基因突變的檢測一致度高達80-90%。

盡管患者的ctDNA水平差異很大，但大部分個體的ctDNA水平與腫瘤負荷、治療反應密切相關。cfDNA在循環(huán)中的半衰期較短，有利于實時監(jiān)測腫瘤負荷。研究表明，由于腫瘤細胞死亡會導致大量釋放ctDAN，因此血漿ctDNA水平在治療開始后可短暫增加，但1-2周內治療療效較好的患者ctDNA水平將顯著下降。ctDNA水平的上升甚至可能先于放射學進展數(shù)周至數(shù)月。cfDNA檢測有望成為監(jiān)測早期治療反應或進展證據(jù)的有力手段。

獲得性耐藥通常以個體中多個耐藥性亞克隆為特征，這些耐藥性亞克隆可以共存于相同的病變或不同的轉移病灶，cfDAN檢測有助于多重耐藥機制的發(fā)現(xiàn)，而單病灶活檢可能會導致低估腫瘤的分子異質性。一項研究發(fā)現(xiàn)，cfDNA檢測可以發(fā)現(xiàn)多達2/3病例中單個腫瘤活檢未發(fā)現(xiàn)的其他突變。因此，基于單個病灶活檢的結果，針對單一耐藥機制進行治療可能會影響治療反應，而cfDNA檢測可一定程度上彌補這一缺陷。cfDNA的分析也可用于追蹤治療期間甚至治療停止后不同亞克隆的克隆動態(tài)。Siravegna等人發(fā)現(xiàn)結直腸癌患者在接受抗EGFR治療期間可能會出現(xiàn)RAS突變，但在抗EGFR治療停止后RAS突變可在cfDNA中降至不可檢測的水平，這部分患者在后續(xù)治療中可從抗EGFR治療的再次用藥中獲益。將實時cfDNA分析整合到臨床試驗中并最終納入標準臨床管理，有可能成為實現(xiàn)精準醫(yī)療的有力工具。 

圖3. 腫瘤的異質性和cfDNA 

cfDNA分析最具變革性的潛在應用之一可能是在影像學之前早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在，有望成為早期腫瘤的篩查工具。一般而言，無淋巴結和遠處轉移的實體瘤，治愈的主要方法是外科手術，不常規(guī)行輔助治療，最終這些患者中約15％可能復發(fā)。檢測術后殘留疾病可以使已經(jīng)治愈的患者免于接受潛在毒性輔助化療，也可以識別那些患有殘留疾病且可能從輔助治療中受益的患者。Diehl等人發(fā)現(xiàn)結直腸癌術后幾周的cfDNA分析可以準確篩查出疾病有殘留的患者。該試驗中先通過對手術標本進行基因測序，明確每個患者的腫瘤特異性突變；接著在術后4周對患者進行采血，通過BEAMing明確血漿中是否持續(xù)存腫瘤特異性突變，這些突變的持續(xù)存在可作為腫瘤細胞殘留的直接證據(jù)。幾項關鍵研究表明，cfDNA中腫瘤特異性突變的術后檢測可以發(fā)現(xiàn)乳腺癌、肺癌和胰腺癌中殘留疾病，預測腫瘤復發(fā)，ctDNA檢測對指導輔助化療的作用的相關研究正在進行中。

液體活檢應用的極致是在健康、無癥狀人群中發(fā)現(xiàn)早期腫瘤。目前，還沒有成熟的技術來實現(xiàn)這一目標，這要求此種方法敏感度較高，能夠檢測微量的cfDNA或由癌前病變、早期癌癥釋放的其他物質，同時還需要高度特異性，以最大限度地減少假陽性結果，降低對接受篩查的真正健康人群的困擾。并且，液體活檢后將準確定位腫瘤原發(fā)灶。此外，一些突變可能存在于良性病變中，cfDNA檢測到的突變也可能源自骨髓中異常的克隆群體。最近的兩項研究表明，液體活檢可用于早期發(fā)現(xiàn)癌癥。陳等人通過檢測血漿中EBV DNA篩查中國患者的鼻咽癌。共有309例患者（1.5％）血漿中檢測到EBV DNA，其中34例患者（0.17％的原始人群）在內鏡評估時確診鼻咽癌，而篩查后一年內只有1例EBV DNA陰性患者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌，綜上該方法的敏感性和特異性分別為97.1％和98.6％。最近，科恩等人開發(fā)的CancerSEEK法，將cfDNA中的突變檢測與循環(huán)蛋白標記結合，敏感性為69％-98％，特異性超過99％。 

圖4. cfDNA分析的臨床應用

cfDNA的分析已迅速成為一種在腫瘤學中具有應用前景的技術。將cfDNA分析應用于臨床需要仔細了解這種方法的優(yōu)勢和局限性，以正確理解結果，科學指導臨床決策。雖然需要進一步的前瞻性研究進行驗證，但cfDNA分析具有對癌癥醫(yī)學產(chǎn)生變革影響的潛力。