可以通過(guò)CAR的表達(dá)將T細(xì)胞導(dǎo)向靶腫瘤細(xì)胞。 CAR是由細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域組成的合成受體，其最常見(jiàn)的是scFv，但也可以采用任何抗原結(jié)合肽的形式。這個(gè)結(jié)合域與細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞激活和共同刺激域相連，不管有沒(méi)有鉸鏈域。盡管CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者中顯示出顯著的效果，但其治療其他血液和實(shí)體腫瘤的效果卻不那么明顯。
這些不明顯的情況可能與腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)。當(dāng)輸注到患者體內(nèi)時(shí)，CAR-T細(xì)胞經(jīng)常遇到抑制性腫瘤微環(huán)境，細(xì)胞和抑制性配體可以與T細(xì)胞上的抑制性受體結(jié)合并阻礙T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。例如，在卵巢癌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免疫抑制的m2 -極化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞存在于腫瘤微環(huán)境中，這些細(xì)胞的存在與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞減少和患者預(yù)后不良有關(guān)。 TAM和Treg細(xì)胞均通過(guò)接觸和細(xì)胞因子介導(dǎo)的機(jī)制抑制浸潤(rùn)的T細(xì)胞。此外，在激活后，T細(xì)胞分泌IFN-γ，一種已顯示可在臨床和臨床前模型中動(dòng)態(tài)上調(diào)卵巢癌細(xì)胞上的程序性死亡配體-1（PD-L1）表達(dá)的細(xì)胞因子。 PD-L1與T細(xì)胞上的抑制性受體程序性死亡1（PD-1）結(jié)合并抑制T細(xì)胞功能。通過(guò)CRISPR介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞上PD-L1的缺失中斷PD-1 / PD-L1連接，改善了過(guò)繼轉(zhuǎn)移的第二代CAR-T細(xì)胞在臨床前模型中的功效。這些因素可能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞缺乏這種實(shí)體腫瘤惡性腫瘤的臨床療效。
使用抗體破壞T細(xì)胞上抑制性受體之間的相互作用，特別是CTLA-4和PD-1，以及它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制性配體的檢查點(diǎn)阻滯療法已經(jīng)在一系列實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中產(chǎn)生了臨床反應(yīng)。檢查點(diǎn)阻斷療法的功效的相關(guān)性包括T細(xì)胞活化標(biāo)記物，PD-L1的腫瘤細(xì)胞表達(dá)，腫瘤中預(yù)先存在的CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤突變負(fù)荷。綜上所述，這些結(jié)果表明腫瘤特異性T細(xì)胞是檢查點(diǎn)阻斷作用的一個(gè)完整機(jī)制，而對(duì)已有腫瘤特異性T細(xì)胞的重新介入對(duì)于這種治療方式的成功至關(guān)重要。
我們之前描述過(guò)“武裝”CAR-T細(xì)胞，它們是CAR-T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)共同修飾以表達(dá)免疫調(diào)節(jié)配體如CD40L或分泌細(xì)胞因子如IL-12或IL-18以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中起作用?；谖覀冎暗陌l(fā)現(xiàn)，我們沒(méi)有將CAR-T細(xì)胞與現(xiàn)有的系統(tǒng)性檢查點(diǎn)封鎖抗體治療結(jié)合起來(lái)，而是像之前在臨床前模型中研究的那樣，我們?cè)噲D使用武裝CAR-T細(xì)胞平臺(tái)來(lái)創(chuàng)建一種單一的治療方法，在這種治療中CAR-T細(xì)胞分泌免疫檢查點(diǎn)封鎖scFv。鑒于CAR-T細(xì)胞向腫瘤輸送，PD-1阻斷性scFv將被局部遞送至疾病部位，從而最小化與免疫檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)的毒性。我們發(fā)現(xiàn)分泌PD-1阻斷scFv的CAR-T細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制增強(qiáng)了同源和異種小鼠模型中PD-L1 +荷瘤小鼠的存活。該策略有可能增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞療法在具有免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的癌癥中的功效。
修飾小鼠CAR-T細(xì)胞以分泌抗小鼠PD-1的scFv
為了測(cè)試我們?cè)诿庖呋钚酝敌∈竽Ｐ椭械姆椒?，我們生成了逆轉(zhuǎn)錄病毒第二代CAR構(gòu)建體，其含有的結(jié)合域可識(shí)別CD19或MUC16（MUC16ecto）和小鼠CD28和CD3 zeta T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的保留部分。常規(guī)CAR分別標(biāo)記為19m28mZ或4H11m28mZ。 裝甲小鼠CAR構(gòu)建體，標(biāo)記為19m28mZ / RMP1-14或4H11m28mZ / RMP1-14，使用相同的骨架，結(jié)合域和小鼠信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域作為第二代小鼠CAR，并且還共同修飾以包括c-myc標(biāo)記的，衍生自抗小鼠PD-1阻斷單克隆抗體（mAb），RMP1-14的可變重鏈和輕鏈的scFv。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)原代小鼠T細(xì)胞以表達(dá)CAR構(gòu)建體并分泌RMP1-14 scFv。
我們將暴露于IFN-γ后上調(diào)PD-L1的表達(dá)人CD19的小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞（hCD19 mPD-L1）或表達(dá)MUC16ecto的卵巢腫瘤ID8細(xì)胞與分泌scFv的CAR-T細(xì)胞共同培養(yǎng)。 當(dāng)與腫瘤靶標(biāo)一起培養(yǎng)時(shí)，常規(guī)和分泌RMP1-14 scFv的CAR-T細(xì)胞被特異性裂解并產(chǎn)生IFN-γ。
我們接下來(lái)評(píng)估了分泌的RMP1-14 scFv與PD-1的結(jié)合。 與修飾為19m28mZ的細(xì)胞相比，19m28mZ / RMP1-14T細(xì)胞上表面PD-1的量顯著減少（P = 0.01），這與自分泌scFvs的CAR-T細(xì)胞結(jié)果一致。細(xì)胞。 為了確定scFv是否與旁觀者PD-1表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，我們?cè)诳装宓牡撞颗囵B(yǎng)4H11m28mZ T細(xì)胞，頂部分別培養(yǎng)19m28mZ和19m28mZ / RMP1-14細(xì)胞。 24小時(shí)后，我們檢測(cè)到與19m28mZ / RMP1-14細(xì)胞共培養(yǎng)的4H11m28mZ細(xì)胞表面PD-1水平低于與19m28mZ T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞（P = 0.04），與分泌的scFvs與旁觀者細(xì)胞的結(jié)合一致。
CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)分泌阻斷PD-1的scFv
我們接下來(lái)驗(yàn)證了腫瘤微環(huán)境中CAR-T細(xì)胞分泌的PD-1阻斷性scFv的存在。將可觸知腹水的荷瘤小鼠腹腔注射CAR-T細(xì)胞。48小時(shí)后收獲這些小鼠的腹水，用anti-myc-tag抗體的免疫沉淀檢測(cè)和western blot分析，可檢測(cè)到通過(guò)4H11m28mZ / RMP1-14T細(xì)胞分泌的RMP1-14 scFvs。
我們接下來(lái)測(cè)試了分泌scFv的CAR-T細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性卵巢癌的同系免疫能力小鼠模型中的功效。將C57BL/6小鼠腹腔注射ID8細(xì)胞，7天后注射CAR-T細(xì)胞。4H11m28mZ/RMP1-14 T細(xì)胞與使用4H11m28mZ (P = 0.004)和使用19m28mZ/RMP1-14 T細(xì)胞對(duì)照(P = 0.0006)的小鼠相比，存活率有所提高。使用4H11m28mZ/RMP1-14 T細(xì)胞或4H11m28mZ T細(xì)胞+ RMP1-14抗體治療，均顯示了類(lèi)似的生存益處(P = 0.051)。單獨(dú)用RMP1-14mAb處理的荷瘤小鼠與用對(duì)照CAR-T細(xì)胞處理的小鼠相比沒(méi)有存活益處。
PD-1與PD-L1結(jié)合可導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭、無(wú)反應(yīng)和/或凋亡。我們發(fā)現(xiàn)，使用4H11m28mZ/RMP1-14 T細(xì)胞或4H11m28mZ T細(xì)胞+ RMP1-14抗體治療的長(zhǎng)期存活小鼠，在腫瘤接種后120 天，可在骨髓中通過(guò)PCR檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞。此外，與原始未治療的小鼠相比，當(dāng)用初始劑量的ID8腫瘤細(xì)胞再次攻擊時(shí)，4H11m28mZ / RMP1-14處理的小鼠能夠產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)（P <>
我們假設(shè)分泌pd -1阻斷scFvs的CAR-T細(xì)胞可以重新激活內(nèi)源性腫瘤特異性T細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們?cè)贑57BL/6小鼠皮下注射免疫原性黑色素瘤細(xì)胞株B16-F10。這些小鼠對(duì)腫瘤產(chǎn)生內(nèi)源性反應(yīng)，但無(wú)法根除。從用4H11m28mZ / RMP1-14 CAR-T細(xì)胞瘤內(nèi)處理的小鼠中分離的內(nèi)源性旁觀者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)的CD80，CD107α，IFN-γ和顆粒酶B水平顯著高于用4H11m28mZ處理的（P <>
人pd -1阻斷scFv E27的選擇
從人scFv噬菌體展示文庫(kù)（Eureka Therapeutics）中分離到人PD-1阻斷scFv E23，E26和E27。 與PD-1結(jié)合的三種候選物E23，E26和E27的解離常數(shù)（KD）分別為8.3,6.3和3.6nM。 E23，E26和E27抗體能夠以劑量依賴(lài)性方式阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合。收集被病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的相同數(shù)量細(xì)胞的上清液，可檢測(cè)到抗PD1可分泌的scFv?？寺27的條帶最強(qiáng)，說(shuō)明scFv在上清中最穩(wěn)定。因此，我們?cè)诤罄m(xù)的研究中使用了E27。
修飾人CAR-T細(xì)胞以分泌抗人PD-1阻斷scFv
我們產(chǎn)生了編碼CD19-或MUC16ecto-靶向CAR和His / HA-標(biāo)記的E27 scFv的人CAR構(gòu)建體（分別為1928z-E27和4H1128z-E27）。 轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞在表面上表達(dá)CAR并分泌E27 scFv。在1928z-E27 T細(xì)胞的上清液中孵育后，通過(guò)HA-tag檢測(cè)293Glv9-PD1+細(xì)胞，證實(shí)了E27與PD-1的結(jié)合。此外，我們?cè)?928z-E27和4H1128z-E27 T細(xì)胞上檢測(cè)到的PD-1低于修飾后表達(dá)1928z或4H1128z的細(xì)胞，這與E27 scFv與T細(xì)胞PD-1的結(jié)合一致。我們?cè)谀[瘤細(xì)胞的背景下證實(shí)了CAR-T細(xì)胞的抗原依賴(lài)性裂解。
我們轉(zhuǎn)導(dǎo)Raji和NALM6腫瘤細(xì)胞以表達(dá)PD-L1，并與Raji-PD-L1或NALM6-PD-L1在1:1腫瘤:CAR-T細(xì)胞比例下共培養(yǎng)1928z和1928z- e27 T。共培養(yǎng)72h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)剩余腫瘤細(xì)胞?？砂l(fā)現(xiàn)1928z-E27 T細(xì)胞比1928z T細(xì)胞裂解更多的Raji-PDL1和NALM6-PDL1腫瘤細(xì)胞。使用該測(cè)定法，我們發(fā)現(xiàn)與1918z T細(xì)胞相比，與Raji-PDL1或NALM-PDL1腫瘤共培養(yǎng)后，1928z-E27 T細(xì)胞的擴(kuò)增增加，與1928z-E27 T細(xì)胞對(duì)PD-L1介導(dǎo)抑制的反應(yīng)一致。與Raji-PD-L1共培養(yǎng)后，1928z-E27細(xì)胞的表面PD-1檢測(cè)水平低于1928z T細(xì)胞，這可通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色的平均熒光強(qiáng)度來(lái)確定。
E27與旁觀者細(xì)胞結(jié)合
為了證明未轉(zhuǎn)導(dǎo)的旁觀者細(xì)胞可以從附近的CAR-T細(xì)胞分泌的E27 scFv中受益，我們首先將健康的人供體T細(xì)胞與1928z或1928z-E27 CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，并通過(guò)抗cd3和抗cd28微珠刺激細(xì)胞。共培養(yǎng)4天后，分選CAR +和CAR-的T細(xì)胞，并通過(guò)western blot分析顯示，在與1928z-E27/PD-1 T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，E27可同時(shí)結(jié)合CAR+和CAR-細(xì)胞上的PD-1，但在與1928z/PD-1 T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)。
分別在1928z和1928z- e27 T細(xì)胞中培養(yǎng)3t3或3T3-PDL1細(xì)胞，并用抗cd3和抗cd28小珠刺激細(xì)胞。與培養(yǎng)于3T3-PDL1細(xì)胞的1928z T細(xì)胞相比，培養(yǎng)于3T3細(xì)胞的1928z T細(xì)胞增殖增強(qiáng)。然而，1928z-E27 T細(xì)胞與3T3和3T3-PDL1培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出的擴(kuò)增情況相似。
當(dāng)用3T3細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，1928z和1928z-E27T細(xì)胞的擴(kuò)增沒(méi)有顯著差異（P = 0.063）。在第12天，3T3-PDL1培養(yǎng)的1928z T細(xì)胞與3t3 培養(yǎng)的細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。我們預(yù)計(jì)CAR +和CAR-細(xì)胞的群體將在這種情況下以相似的比例收縮，并且總體CAR +百分比將相對(duì)于時(shí)間0保持相同。這是我們?cè)谟?jì)算CAR +細(xì)胞相對(duì)于時(shí)間0時(shí)觀察到的情況。然而，因?yàn)榕c3T3-PDL1細(xì)胞一起培養(yǎng)的1928z-E27細(xì)胞在第12天顯著擴(kuò)增，可以預(yù)期CAR +細(xì)胞的總數(shù)將增加，從而導(dǎo)致CAR +細(xì)胞的百分比增加。如果阻斷PD-1的scFv僅賦予分泌它的細(xì)胞選擇性增殖優(yōu)勢(shì)，則情況就是這樣。然而，在3T3-PDL1細(xì)胞擴(kuò)增后的CAR+ 1928z-E27 T細(xì)胞的比例在第12天與第0天相比沒(méi)有增加，說(shuō)明在PD-L1環(huán)境下，E27 scFv同時(shí)保護(hù)了轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞擴(kuò)增和未轉(zhuǎn)化的旁觀者細(xì)胞的擴(kuò)增。
分泌E27 scFv的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)具有增強(qiáng)的抗腫瘤功能
我們通過(guò)靜脈注射Raji-PDL1或NALM6-PDL1腫瘤細(xì)胞給SCID/ Beige小鼠接種，來(lái)測(cè)定分泌E27的CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤功效。1與輸注1928z T細(xì)胞相比，輸注1928z-E27 T細(xì)胞顯著增強(qiáng)了Raji-PDL1（P = 0.03）和NALM6-PDL1（P = 0.01）荷瘤小鼠的存活率。
接下來(lái)，我們研究了分泌E27的CAR-T細(xì)胞在腹膜癌的實(shí)體瘤模型中的抗腫瘤功效。與用4H1128z T細(xì)胞處理的小鼠相比，用4H1128z-E27T細(xì)胞處理的攜帶SKOV3-PDL1腫瘤的SCID / Beige小鼠的存活率提高（P = 0.02）。 此外，使用這種轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤的臨床前異種移植模型，用分泌E27 scFv 的4H1128z T細(xì)胞治療的小鼠比用4H1128z T細(xì)胞+抗人PD-1 單克隆抗體治療的小鼠存活率更高（P = 0.048）。
為了在體內(nèi)證明分泌E27的CAR-T細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)，我們用抗原無(wú)關(guān)的1928z-E27和腫瘤特異性4H1128z CAR-T細(xì)胞的組合處理攜帶SKOV3-PD-L1的小鼠。 在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校瑑H抗原不相關(guān)的CAR-T細(xì)胞表達(dá)PD-1阻斷性scFv，并且僅用1928z-E27 T細(xì)胞處理沒(méi)有存活益處。 然而，與僅用4H1128z T細(xì)胞處理的小鼠相比，當(dāng)一起注射時(shí)，1928z-E27增強(qiáng)了第二代4H1128z細(xì)胞的抗腫瘤功能（P = 0.03）。 該結(jié)果表明，1928z-E27細(xì)胞分泌的E27 scFv在體內(nèi)與旁觀者腫瘤特異性細(xì)胞結(jié)合。
CAR-T細(xì)胞分泌的E27 scFv僅在腫瘤微環(huán)境局部檢測(cè)到
使用SKOV3腹膜癌病的實(shí)體腫瘤模型，我們?cè)噲D確定CAR分泌的scFv的局部和全身水平。首先，當(dāng)腹膜內(nèi)給藥時(shí)，我們利用體內(nèi)生物發(fā)光和熒光成像來(lái)觀察scFv或單克隆抗體的位置隨時(shí)間推移的變化。使用與Gaussia Luciferase（GLuc）酶融合的E27 scFv產(chǎn)生CAR構(gòu)建體，在CAR-T細(xì)胞分泌E27后，可不依賴(lài)于ATP信號(hào)并成像顯示E27在體內(nèi)的位置。我們將一種商業(yè)化的抗人PD-1單克隆抗體與680 XL熒光色素結(jié)合。將分泌E27-GLuc或CAR-T細(xì)胞和熒光標(biāo)記的單克隆抗體的CAR-T細(xì)胞注射到荷瘤小鼠體內(nèi)并隨時(shí)間成像。最早在3h時(shí)，該抗體可在小鼠體內(nèi)系統(tǒng)性發(fā)現(xiàn)，而scFv僅在腹腔內(nèi)檢測(cè)到。定量后，我們沒(méi)有觀察到E27的全身和局部量之間的差異，因?yàn)镋27仍然位于腫瘤部位。然而，我們發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的商業(yè)抗體水平發(fā)生變化，因?yàn)樗坪踉谀[瘤區(qū)域外循環(huán)。
我們使用高分辨率的四極質(zhì)譜儀 orbitrap儀器來(lái)進(jìn)一步量化抗體或scFv隨著時(shí)間的變化。我們對(duì)SCID / Beige小鼠腹腔注射了卵巢癌SKOV3腫瘤細(xì)胞，7天后，腹腔注射分泌E27的CAR-T細(xì)胞或抗體和CAR-T。我們隨時(shí)間收集血清樣品并進(jìn)行靶向平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)光譜測(cè)定以量化E27或商業(yè)抗體隨時(shí)間的數(shù)量變化。使用了兩種獨(dú)特的胰蛋白酶肽，它們來(lái)自于scFv和單克隆抗體的互補(bǔ)區(qū)，在其他小鼠或人類(lèi)蛋白中不存在。在血清中系統(tǒng)性檢測(cè)到商業(yè)pd -1阻斷單抗，并隨著時(shí)間的推移呈下降趨勢(shì)。然而，我們沒(méi)有在血清中任何時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到E27，這表明它仍然局限于TME。靜脈內(nèi)注射由分離的scFv組成的對(duì)照樣品。證明我們的測(cè)定法能夠檢測(cè)外周血清中的E27。重要的是要注意抗體和scFv分子的穩(wěn)定性和半衰期不同，這可能影響我們檢測(cè)血清中scFv的能力。然而，考慮到我們發(fā)現(xiàn)scFv可在全身輸注后30分鐘檢測(cè)到，并且在我們的系統(tǒng)中，scFv由CAR T細(xì)胞在體內(nèi)組成型生成，如果它存在于外周，我們應(yīng)該能夠檢測(cè)CAR -T-細(xì)胞衍生的E27。此外，如果scFv的穩(wěn)定性和半衰期不允許其離開(kāi)局部腫瘤微環(huán)境并在外周檢測(cè)到，這進(jìn)一步推動(dòng)了我們的假設(shè)，即使用scFv的局部檢查點(diǎn)阻斷可能是抗體的更安全的替代方案。這些結(jié)果表明，與檢查點(diǎn)阻斷單抗不同，CAR-T細(xì)胞分泌的E27不是全身存在的。
通過(guò)多種體內(nèi)模型，我們證明了分泌PD-1阻斷scFv的CAR-T細(xì)胞，可增強(qiáng)同源和臨床前異種血液學(xué)和實(shí)體腫瘤模型中小鼠的存活率。 分泌PD-1阻斷性scFv的CAR-T細(xì)胞具有相同效果或更優(yōu)于用CAR-T細(xì)胞和PD-1阻斷性單抗的治療，表明PD-1阻斷的局部遞送在增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤方面是有效的。PD-1阻斷的CAR-T細(xì)胞治療的長(zhǎng)生存期的小鼠，可以在小鼠的骨髓中檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞，并且，當(dāng)腫瘤再次攻擊時(shí)產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)。由CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的PD-1阻斷性scFv可以在腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤特異性旁觀者T細(xì)胞的功能。 最后，與全身檢查點(diǎn)阻斷療法不同，CAR-T細(xì)胞分泌的scFv僅保留在腫瘤微環(huán)境的局部。
前期臨床研究表明，CAR-T細(xì)胞易受PD-1受體介導(dǎo)的抑制效應(yīng)功能的影響，并隨后與PD-1/ pdl -1阻斷抗體聯(lián)合使用(外源或CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生)，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)增強(qiáng)。然而，這些研究局限于異種移植模型，這些模型不能重現(xiàn)內(nèi)源性免疫抑制TME，并且沒(méi)有證明旁觀者效應(yīng)或抗體的局部遞送。具體而言，先前的研究使用分泌抗體（不是scFv）的CAR-T細(xì)胞，并且沒(méi)有將其與單獨(dú)的抗體或CAR-T細(xì)胞和全身抗體進(jìn)行比較;因此，他們的方法是否優(yōu)于既定療法尚不清楚。ScFvs是比抗體更小，更不穩(wěn)定的分子，并且沒(méi)有用它們證明成功的檢查點(diǎn)阻斷。此外，較小尺寸的scFv使得能夠設(shè)計(jì)較小的CAR構(gòu)建體，從而允許將來(lái)具有scFv組合的三順?lè)醋虞d體的可能性。
預(yù)防與PD-1相關(guān)的CAR-T細(xì)胞應(yīng)答抑制的替代方法包括共表達(dá)嵌合轉(zhuǎn)換受體，PD-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與激活信號(hào)結(jié)構(gòu)域連接，或共修飾CAR-T細(xì)胞以表達(dá) 顯性負(fù)性PD-1受體。 與僅表達(dá)CAR的T細(xì)胞相比，這兩種方法均能提高PD-L1+腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解、細(xì)胞因子分泌水平，并增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤作用。然而，這種保護(hù)作用僅限于CAR-T細(xì)胞本身。腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)源性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞仍然受到PD-1介導(dǎo)的抑制。鑒于CAR-T細(xì)胞分泌的pd -1阻斷scFvs能夠與旁觀者細(xì)胞結(jié)合，我們推測(cè)本文描述的pd -1阻斷scFvs局部分泌可能保護(hù)內(nèi)源性抗腫瘤免疫細(xì)胞，減少抗原陰性腫瘤的生長(zhǎng)。
檢查點(diǎn)阻滯的全身給藥可導(dǎo)致免疫相關(guān)不良事件（IRAEs）。 IRAEs在接受檢查點(diǎn)封鎖治療的患者中很常見(jiàn)。 鑒于CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位傳輸和擴(kuò)張，PD-1阻斷性scFv的遞送主要定位于我們模型中的這些區(qū)域。 因此，我們假設(shè)我們的策略，展示局部而不是系統(tǒng)的傳遞，可能會(huì)減少與系統(tǒng)檢查點(diǎn)封鎖相關(guān)的IRAEs。
我們的結(jié)果驗(yàn)證了CAR-T細(xì)胞可以在無(wú)系統(tǒng)阻斷的情況下將免疫調(diào)節(jié)scFvs傳遞給腫瘤微環(huán)境的觀點(diǎn)。隨著人類(lèi)噬菌體展示文庫(kù)的快速發(fā)展，利用scFvs靶向其他分子，如lag3、TIM-3或CLTA-4，以及組合策略，擴(kuò)展這種免疫調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞方法是可行的。裝甲CAR-T細(xì)胞靶向向腫瘤微環(huán)境輸送免疫調(diào)節(jié)scFvs，可提高CAR-T細(xì)胞及檢查點(diǎn)封鎖治療的臨床療效。
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