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為了探索黑素瘤腫瘤的不同基因型和表型狀態(tài)，研究人員對(duì)從19位患者中分離出的4645個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，區(qū)分其中的惡性，免疫，基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞。同一腫瘤內(nèi)的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出與細(xì)胞周期，空間環(huán)境和抗藥性程序相關(guān)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。而且所有的腫瘤都有兩種不同轉(zhuǎn)錄模式，使得高表達(dá)MITF的腫瘤也會(huì)含有低表達(dá)MITF和高表達(dá)AXL激酶的細(xì)胞。單細(xì)胞分析能夠分析不同的腫瘤微環(huán)境模式，包括細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用等。腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的分析揭示了T細(xì)胞的耗竭過(guò)程，耗竭過(guò)程與T細(xì)胞活化和克隆擴(kuò)展的聯(lián)系，以及患者之間變異性等特點(diǎn)。該項(xiàng)研究為解開(kāi)腫瘤的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，以及單細(xì)胞基因組學(xué)如何助力靶向治療和免疫治療這一問(wèn)題提供了線索。

樣本選擇

研究人員對(duì)19個(gè)黑色素瘤腫瘤的4645個(gè)惡性、免疫和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，這19個(gè)樣品來(lái)源包括淋巴組織10例（淋巴結(jié)9例，脾1例），皮下或肌肉組織5例，胃腸道3例，原發(fā)性肢端黑素瘤1例。19個(gè)腫瘤中的17個(gè)已經(jīng)有基因分型信息，其中4個(gè)在BRAF中具有活化突變，在NRAS癌基因中有5個(gè);8名患者有BRAF/NRAS野生型的黑色素瘤。

單細(xì)胞測(cè)序流程

為了分離適合高質(zhì)量單細(xì)胞RNA-seq的活細(xì)胞，研究人員開(kāi)發(fā)了快速轉(zhuǎn)錄分析的工作流程。他們?cè)谑中g(shù)采集后立即處理腫瘤組織并在約45分鐘內(nèi)產(chǎn)生單細(xì)胞懸液，盡量避免由分解聚集，溫度或時(shí)間引起的人為轉(zhuǎn)錄變化。一旦處于懸浮狀態(tài)，研究人員就開(kāi)始通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（熒光激活細(xì)胞分選）分選免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）細(xì)胞（包括惡性和基質(zhì)細(xì)胞）。并反轉(zhuǎn)錄獲取單細(xì)胞cDNA，構(gòu)建文庫(kù)以及測(cè)序。每個(gè)細(xì)胞的平均read約為15萬(wàn)；另外惡性細(xì)胞里有4659個(gè)基因表達(dá)，而免疫細(xì)胞則是有3438個(gè)基因表達(dá)。

圖1  流程概覽

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜區(qū)分惡性和非惡性細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)

研究人員采用基因和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)來(lái)區(qū)分黑素瘤腫瘤內(nèi)的不同細(xì)胞類型。通過(guò)在各自的染色體上延伸100個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行CNV（15）（圖2B），而CNV的非整倍性的細(xì)胞可分類為惡性細(xì)胞。因此能將單細(xì)胞分為惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞。其次，對(duì)細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)降維(t-SNE)和密度聚類。惡性細(xì)胞分成了6個(gè)單獨(dú)的簇（圖2C），表明高度的腫瘤異質(zhì)性。相反，非惡性細(xì)胞由細(xì)胞類型聚類。B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和自然殺傷細(xì)胞都有其特異表達(dá)基因作為mark來(lái)識(shí)別（圖2D）。

圖2  惡性和非惡性細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)分類

惡性細(xì)胞的異質(zhì)性

接著研究人員對(duì)惡性細(xì)胞進(jìn)行了分析，來(lái)鑒定生物相關(guān)的黑素瘤細(xì)胞狀態(tài)。他們先進(jìn)行了主成分分析（PCA），得到了六個(gè)主要成分。

第一種成分與每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)量高度相關(guān)，可能反映技術(shù)方面的問(wèn)題；而其他五個(gè)重要的主要成分突出生物變異性。

第二種成分（PC2）與細(xì)胞周期基因的表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞周期階段G1/S或G2/M期相關(guān)的signature基因在惡性細(xì)胞亞群中高度表達(dá)。根據(jù)這些signature基因能將腫瘤細(xì)胞分類為低循環(huán)（1至3％，Mel79）和高循環(huán)腫瘤（20至30％，Mel78），說(shuō)明腫瘤周期細(xì)胞部分的變異性，與Ki67+染色結(jié)果一致（圖3B）。

其中值得注意的是細(xì)胞周期蛋白D3（CCND3）僅存在于高周期性腫瘤的周期性細(xì)胞(cycling cells)中。相反，KDM5B（JARID1B）與非周期性細(xì)胞（圖3A，綠色圓點(diǎn)）顯示最強(qiáng)的相關(guān)性，與小鼠和體外模型中的觀察結(jié)果一致（圖3C）。

第三種成分和第六種成分（PC3和PC6）主要從一種未治療的腫瘤（Mel79）中分離不同的惡性細(xì)胞。

圖3  細(xì)胞周期異質(zhì)性

綜合上述觀察結(jié)果，治療前黑素瘤可能存在靶向治療無(wú)效的亞群。PC4和PC5與MITF基因表達(dá)量高度相關(guān)，MITF（小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）是皮膚中黑色素細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)基因。研究人員在這兩個(gè)亞群里發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)基因組合。其中MITF本身和幾種MITF靶基因（包括TYR，PMEL和MLANA）組成的“MITF高表達(dá)”組合基因。第二個(gè)“AXL高表達(dá)”組合基因，與“MITF高表達(dá)”組合基因呈負(fù)相關(guān)，該組合包括AXL和NGFR基因，這些基因是各種靶向治療耐藥的標(biāo)志物和推斷黑色素瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。通過(guò)這兩個(gè)組合可區(qū)分黑素瘤腫瘤，細(xì)胞系，和鼠標(biāo)模型，另外“AXL高表達(dá)”與RAF和MEK抑制的內(nèi)在抗性有關(guān)。

在大腫瘤水平，每個(gè)黑色素瘤可以分為“MITF高表達(dá)”或“AXL高表達(dá)”的其中一種模式。（圖4A），但在單細(xì)胞水平上，每個(gè)腫瘤都含有對(duì)應(yīng)于兩種轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的惡性細(xì)胞。使用單細(xì)胞RNA-seq檢查含有MITF、AXL基因的細(xì)胞表達(dá)情況，觀察到MITF高表達(dá)的腫瘤（包括未經(jīng)治療的黑色素瘤）含有AXL高表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞的亞群，也就是說(shuō)MITF和AXL在一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)高表達(dá)，反之亦然（圖4B）。這是通過(guò)非單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)不到的，例如在整體腫瘤分析中，通過(guò)IF染色，MITF-high和AXL-high的表達(dá)相互排斥的，是觀察不到單細(xì)胞水平的表達(dá)情況的（圖4C）。因此，在每個(gè)腫瘤中，惡性細(xì)胞在AXL和MITF高轉(zhuǎn)錄狀態(tài)之間是連續(xù)的（圖4B）。

由于AXL和MITF高轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的惡性細(xì)胞在黑色素瘤中共存，研究人員通過(guò)耐藥性實(shí)驗(yàn)證明用RAF和MEK抑制劑治療會(huì)增加“AXL高表達(dá)”細(xì)胞在耐藥性發(fā)展后的發(fā)病率。

圖4  耐性腫瘤異質(zhì)性

非惡性細(xì)胞及其在黑色素瘤微環(huán)境中的相互作用

各種非惡性細(xì)胞構(gòu)成腫瘤微環(huán)境。微環(huán)境的組成對(duì)腫瘤發(fā)生以及治療反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有重要作用。例如，T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)可預(yù)測(cè)各種癌癥類型對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)。

為了確定黑色素瘤微環(huán)境的組成，研究人員用單細(xì)胞RNA-seq表達(dá)譜的signature基因得到五種分類：T細(xì)胞，B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和CAF。并使用這些signature基因來(lái)推斷整體腫瘤中5種細(xì)胞類型的相對(duì)豐度（圖5A）。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤純度與DNA分析預(yù)測(cè)有很強(qiáng)的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R?0.8）（圖5A，熱點(diǎn)圖下面的第一條泳道）。

研究人員根據(jù)其推斷的細(xì)胞類型組成將471個(gè)來(lái)自TCGA的腫瘤分成10個(gè)不同的微環(huán)境簇（圖5A）。除了一些例外（例如，簇8和9）外，簇主要獨(dú)立于轉(zhuǎn)移部位。

那么，這些不同的微環(huán)境如何與惡性細(xì)胞的表型相關(guān)？

特別是CAF豐度可以預(yù)測(cè)不同AXL-MITF模式，CAF富集的腫瘤細(xì)胞具有AXL-high的特征。MITF-high特征的腫瘤細(xì)胞與CAF豐度呈負(fù)相關(guān)。CAF的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用有很大的關(guān)聯(lián)。另外，黑色素瘤細(xì)胞和CAF均高表達(dá)AXL。

細(xì)胞之間的相互作用在腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。為了評(píng)估細(xì)胞間相互作用如何影響腫瘤組成，研究人員開(kāi)發(fā)了影響或反映腫瘤中不同類型細(xì)胞比例的細(xì)胞表達(dá)的基因。其中補(bǔ)體因子3（C3）水平（CAF表達(dá)的補(bǔ)體基因之一）與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)之間有高相關(guān)性（R>0.8）。研究人員對(duì)原發(fā)性腫瘤，轉(zhuǎn)移性病變，正常皮膚和鄰近腫瘤以及健康皮膚對(duì)照在內(nèi)的308個(gè)核心活檢組織（圖5C）進(jìn)行了雙重IF染色和定量載玻片分析（圖5C），與根據(jù)黑色素瘤樣本分析的結(jié)果一致，補(bǔ)體因子與許多癌癥類型中的T細(xì)胞豐度的推斷相關(guān)，并且比正常組織更高。盡管相關(guān)分析不能確定因果關(guān)系，但這表明細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用存在潛在的體內(nèi)作用。

圖5  非惡性細(xì)胞分類

腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的多樣性及其功能狀態(tài)

TILs，特別是CD8+T細(xì)胞的活性是免疫監(jiān)視的主要決定因素。在正常情況下，暴露于抗原和共刺激因子的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞可能有介導(dǎo)惡性細(xì)胞裂解和控制腫瘤生長(zhǎng)的功能。然而，這種功能可能會(huì)受到腫瘤介導(dǎo)而耗竭，從而T細(xì)胞不能激活細(xì)胞毒性效應(yīng)功能。通過(guò)在T細(xì)胞表面（PD-1，TIM-3，CTLA-4，TIGIT，LAG3等）上刺激檢測(cè)點(diǎn)分子來(lái)促進(jìn)疲勞。檢查點(diǎn)機(jī)制的阻斷已經(jīng)在黑素瘤和其他惡性腫瘤的亞群中顯示出臨床益處，但是對(duì)于免疫檢查點(diǎn)阻斷治療，目前沒(méi)有找到臨床反應(yīng)的生物標(biāo)志物。而通過(guò)單細(xì)胞分析可能找到的決定因素，并可能找到新的免疫治療靶點(diǎn)。

研究人員分析了來(lái)自15個(gè)黑素瘤的2068個(gè)T細(xì)胞的模式（圖6A）。鑒定了T細(xì)胞及其主要亞群[CD4+，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和CD8+]。在CD4+和CD8+群體中，PCA根據(jù)初始和細(xì)胞毒性T細(xì)胞基因的表達(dá)（圖6A和B）區(qū)分細(xì)胞亞群和活化狀態(tài)的異質(zhì)性。而耗竭基因表達(dá)也與細(xì)胞毒性標(biāo)記物和總體T細(xì)胞活化狀態(tài)的表達(dá)高度相關(guān)（圖6B）。

我們使用Mel75 來(lái)估計(jì)每個(gè)單元的耗盡狀態(tài)。耗竭狀態(tài)被定義為耗竭基因相對(duì)于細(xì)胞毒性基因具有高或低表達(dá)（圖6D）。實(shí)驗(yàn)確定了28個(gè)基因核心耗竭基因，這些基因在大多數(shù)腫瘤的高度耗竭細(xì)胞（包括共抑制（TIGIT）和共刺激（TNFRSF9/4-1BB和CD27）受體）中持續(xù)上調(diào)（圖6E）。這些腫瘤特異耗竭基因的表達(dá)量可以反映免疫治療前后的效果。

最后，研究人員分析了T細(xì)胞狀態(tài)與克隆擴(kuò)增之間的關(guān)系。識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞可能增殖，產(chǎn)生可辨別的由相同T細(xì)胞受體（TCR）序列定義的克隆亞群。為了鑒定潛在擴(kuò)增的T細(xì)胞克隆，我們使用RNA-seq讀數(shù)，將其映射到TCR，通過(guò)它們的a和bTCR鏈的V和J片段的同源性對(duì)單個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行分類 。在Mel75中大約一半的CD8+T細(xì)胞具有確定的七種富集組合中的一種（FDR=0.005），因此可能代表擴(kuò)大的T細(xì)胞克隆（圖6G）。這種假定的T細(xì)胞擴(kuò)張也與衰竭有關(guān)（圖6H），使得擴(kuò)張的T細(xì)胞（具有多于六個(gè)細(xì)胞的TCR簇）中的低耗竭T細(xì)胞被消耗，并且富集非擴(kuò)張的T細(xì)胞。特別是，非耗竭的毒性細(xì)胞幾乎都是非擴(kuò)增的細(xì)胞（圖6H）?？偟膩?lái)說(shuō)，這個(gè)分析表明，單細(xì)胞RNA-seq分析結(jié)果可能支持功能可變的T細(xì)胞群這一推斷，其他方法不能都檢測(cè)到。以上結(jié)論有利于腫瘤治療以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗性研究。

圖6  腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的多樣性及其功能狀態(tài)

在此之前，科學(xué)家們大多數(shù)進(jìn)行“大體積（bulk）”腫瘤測(cè)序，特別是為了研究整塊腫瘤組織，利用RNA測(cè)序（RNA-seq）或DNA測(cè)序（DNA-seq）分析癌癥基因組或轉(zhuǎn)錄組。尤其是對(duì)RNA-seq而言，對(duì)整塊腫瘤組織進(jìn)行分析受到限制，這是因?yàn)槿藗冄芯康氖悄[瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的混合物，所有的這些細(xì)胞混合在一起，它們可能會(huì)或可能不會(huì)導(dǎo)致癌癥惡化和耐藥性。

在這項(xiàng)新的研究中，研究人員利用單細(xì)胞RNA-seq方法每次一個(gè)細(xì)胞地研究整個(gè)腫瘤以便確定哪些類型的細(xì)胞存在于腫瘤中。他們不僅分析了惡性腫瘤細(xì)胞，而且也分析了腫瘤內(nèi)所有不同類型的細(xì)胞。這是首次開(kāi)展這樣的研究。如今，他們知道每種腫瘤的細(xì)胞組成，也知道每種類型的細(xì)胞的基因表達(dá)模式，這樣就能夠回過(guò)頭去重新分析一些大體積腫瘤測(cè)序數(shù)據(jù)（比如，癌癥基因組圖譜），以便從現(xiàn)存的數(shù)據(jù)中找出細(xì)胞如何相互作用和一定程度上利用細(xì)胞重建大塊腫瘤樣品的整體行為。

單細(xì)胞RNA-seq是一種相對(duì)較新的方法，但是它可能有助解決與腫瘤中細(xì)胞多樣性相關(guān)的問(wèn)題。主要原因在于理解這種多樣性：當(dāng)醫(yī)生治療癌癥時(shí)，一些病人對(duì)治療作出反應(yīng)，而其他病人不會(huì)，而且即便對(duì)治療作出較好的反應(yīng)，癌癥也經(jīng)常會(huì)復(fù)發(fā)。人們也并不理解為何一些細(xì)胞可能被殺死，而其他的細(xì)胞可能不會(huì)被殺死，但是人們猜測(cè)這種差異與腫瘤環(huán)境中的細(xì)胞多樣性存在關(guān)聯(lián)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Itay Tirosh,Benjamin Izar, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma bysingle-cell RNA-seq[J]. Science, 2016,352(6282): 189–196.