2019年3月30日/醫(yī)麥客 eMedClub/--CAR-T療法的起源可以追溯到近30年前，20世紀(jì)90年代初，將基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)剛剛開始發(fā)展。Michel Sadelain博士，現(xiàn)在是MSK(紀(jì)念斯隆-凱特林癌癥中心)細(xì)胞工程中心主任，想利用這些新技術(shù)來改造T細(xì)胞，使它們具備更強(qiáng)的能力。
這在當(dāng)時(shí)如同白日夢(mèng)，十年后的2002年，Sadelain博士和他的MSK同事，包括Isabelle Rivière和Renier Brentjens，發(fā)表了一篇具有開創(chuàng)性的文章，表明用嵌合抗原受體(CAR)工程化的T細(xì)胞可以殺死腫瘤細(xì)胞并持續(xù)存在于體內(nèi)。他們也是第一批證明，靶向血細(xì)胞表面的CD19標(biāo)記物是殺死白血病和淋巴瘤的好方法。
來自MSKCC的CAR-T細(xì)胞療法先驅(qū): (左起) Isabelle Rivière、Michel Sadelain和Renier Brentjens（圖片來源：MSKCC）
目前，自體(患者來源的)CAR-T細(xì)胞療法已顯示出對(duì)多種B細(xì)胞惡性腫瘤的顯著療效，最近的早期臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明其治療多發(fā)性骨髓瘤的潛力。然而，盡管反應(yīng)率很高，部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)；其中一些是抗原陰性，另一些是抗原低表達(dá)。與導(dǎo)致完全和永久性抗原丟失的機(jī)制不同，那些導(dǎo)致抗原低表達(dá)的腫瘤逃逸機(jī)制仍未明確。
3月27日，權(quán)威期刊Nature上發(fā)表MSK研究人員Michel Sadelain和Isabelle Rivière等人的最新發(fā)現(xiàn)：白血病小鼠模型的研究顯示，CARs通過胞啃(trogocytosis, 一種免疫細(xì)胞具有的吞噬機(jī)制)引起腫瘤細(xì)胞的可逆性抗原丟失。這是一種活躍的過程，其中靶抗原被轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞，通過促進(jìn)T細(xì)胞殺傷和T細(xì)胞衰竭，降低腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的靶抗原密度和降低T細(xì)胞活性。
該研究中，這些機(jī)制發(fā)現(xiàn)基于CD28和4-1BB的CAR，取決于抗原密度會(huì)有所差異。作者指出，這些動(dòng)態(tài)特征可以通過協(xié)同殺傷和組合靶向來抵消，以增強(qiáng)腫瘤對(duì)免疫療法的反應(yīng)。
首先，研究人員將有限劑量的CD19 CAR-T細(xì)胞注入免疫缺陷的NALM6急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)小鼠模型中，模擬CAR治療復(fù)發(fā)：包含CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR(分別稱為19-28ζ或19-BBζ)，在0.4×10^6-1.0×10^6 CAR-T細(xì)胞的劑量時(shí)有效控制NALM6細(xì)胞，但在0.2×10^6個(gè)細(xì)胞的劑量下，允許頻繁白血病復(fù)發(fā)。
盡管兩種類型的CAR-T細(xì)胞在輸注后兩周顯示有限的衰竭證據(jù)，但復(fù)發(fā)時(shí)19-BBζ細(xì)胞顯著耗盡，而19-28ζ細(xì)胞不再被檢測(cè)到，符合臨床經(jīng)驗(yàn)和CAR壓力測(cè)試模型。CD19表達(dá)在19-BBζ NALM6復(fù)發(fā)時(shí)減少，在19-28ζ復(fù)發(fā)和未處理的小鼠中保持不變。CD19的丟失發(fā)生在早期(第14天)，表明這在大量CAR-T細(xì)胞存在的情況下也會(huì)發(fā)生。包含單鏈Fv(scFv)抗體片段SJ25C116或FMC6313-15的CD19 CAR中發(fā)現(xiàn)了相同的模式。
CD19在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低的同時(shí)，大部分CAR-T細(xì)胞CD19染色呈陽(yáng)性。值得注意的是，在短期培養(yǎng)后，回收的NALM6細(xì)胞中CD19表達(dá)是可逆的。此外，CD19 mRNA的表達(dá)幾乎沒有變化，這些發(fā)現(xiàn)表明，在CAR-T細(xì)胞存在的情況下，CD19發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)錄后丟失。
原來是胞啃作用！
當(dāng)新鮮NALM6細(xì)胞從跨孔中的CAR-T細(xì)胞分離時(shí)，CD19表達(dá)沒有變化，但是當(dāng)CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)迅速減少，在與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或表達(dá)非信號(hào)CD19 CAR-T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)CD19丟失。
因此，CD19蛋白從NALM6細(xì)胞向T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移顯示出CAR介導(dǎo)的胞啃作用的特征，并且通過肌動(dòng)蛋白聚合阻斷劑的抑制而進(jìn)一步加重。
大量研究證據(jù)表明，表面蛋白在免疫細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象很普遍。通常，胞啃作用的過程是抗原依賴性的，其中一個(gè)最著名的例子是肽-主要組織相容性復(fù)合物(MHC)從抗原呈遞細(xì)胞(APC)轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞。
與表達(dá)CD19-mCherry融合分子的CD19敲除NALM6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞中mCherry和CD19，表明全蛋白CD19膜提取。
表達(dá)CD19-mCherry的NALM6細(xì)胞裝載重鏈氨基酸，19-28ζ細(xì)胞裝載輕鏈氨基酸，然后分離mCherry陽(yáng)性胞啃陽(yáng)性(trog+)和陰性(trog-)單線態(tài)T細(xì)胞，這種短暫共培養(yǎng)物明確證實(shí)了trog+中存在CD19肽，并且沒有在trog-中發(fā)現(xiàn)。
CD81(可與CD19形成復(fù)合物)也在trog+而不是trog- T細(xì)胞中檢測(cè)到，同時(shí)在共培養(yǎng)的NALM6細(xì)胞中丟失。相反，CD22在NALM6細(xì)胞中保持不變，并且未在T細(xì)胞中檢測(cè)到。
與NALM6、SUP-B15、Raji和CD19+ SK-OV-3等細(xì)胞系共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)類似的CD19胞啃，更為重要的是，同樣發(fā)生在與自體19-28ζ細(xì)胞與ALL或慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者的原始樣本共培養(yǎng)后。
所有其他測(cè)試的CAR靶標(biāo)也觀察到CAR誘導(dǎo)的胞啃作用，包括CD22、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)和間皮素。
因此，胞啃作用導(dǎo)致的靶抗原獲取是CAR-T細(xì)胞的一般特征，可能適用于許多(如果不是全部)抗原。
復(fù)發(fā)機(jī)制：胞啃 → 靶抗原下調(diào)+(自相殘殺)T細(xì)胞殺傷 (→ T細(xì)胞衰竭)
由于胞啃作用，CAR-T細(xì)胞吃掉腫瘤細(xì)胞上的靶抗原。隨著其越來越多的CD19穩(wěn)定表達(dá)，19-28ζ和19-BBζ細(xì)胞均參與CD19+ T細(xì)胞殺傷，前者更多，與其更大的效應(yīng)功能一致。這種自相殘殺通過trog+細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、LAG-3和TIM-3的表達(dá)增加而得到減輕，并且19-28比19-BBζ細(xì)胞更多。在穩(wěn)定共表達(dá)CAR和CD19的T細(xì)胞中，那些沒有死于自相殘殺的T細(xì)胞傾向于獲得耗盡標(biāo)記物。
在最初的19-BBζ處理后10天，輸注“新鮮的”19-BBζ T細(xì)胞未能挽救復(fù)發(fā)傾向的小鼠，表明CD19密度已經(jīng)降低到19-BBζ閾值功效以下的水平。然而，19-28ζ CAR-T細(xì)胞確實(shí)挽救了這些復(fù)發(fā)。
研究表明，兩種CAR之間存在抗原敏感性差異。攜帶NALM6 med或NALM6 low腫瘤的小鼠(分別在CD19基因的單等位基因或雙等位基因破壞后獲得)顯示對(duì)低劑量CAR治療的反應(yīng)減弱，其中19-28ζ細(xì)胞始終誘導(dǎo)比19-BBζ細(xì)胞更長(zhǎng)的存活。
這些研究證實(shí)，僅降低靶抗原密度就能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞抗性。加上T細(xì)胞衰竭和(自相殘殺)T細(xì)胞殺傷，從而導(dǎo)致抗原低表達(dá)的腫瘤復(fù)發(fā)。
策略一：合理的CAR-T細(xì)胞劑量
值得注意的是，當(dāng)以較高劑量給藥時(shí)，19-BBζ細(xì)胞能夠控制野生型NALM6。由此，作者假設(shè)：靶細(xì)胞比率可以克服上述的克隆靈敏度閾值。如下所示：
CAR-T細(xì)胞協(xié)同性潛在增強(qiáng)克隆性腫瘤溶解不足（圖片來源：Nature）
在含有1個(gè)CAR-T細(xì)胞和1個(gè)NALM6細(xì)胞(1:1 E:T)的微孔中，19-28ζ細(xì)胞比19-BBζ細(xì)胞更可能溶解NALM6細(xì)胞(24小時(shí)內(nèi)57％對(duì)39％)。形成T細(xì)胞-NALM6細(xì)胞結(jié)合物后，19-28ζ細(xì)胞在261±18分鐘后殺死NALM6細(xì)胞，而19-BBζ細(xì)胞在569±35分鐘內(nèi)殺死NALM6細(xì)胞。19-BBζ細(xì)胞較低的殺傷能力并不是由于較差的抗原識(shí)別，因?yàn)榉橇呀庑苑€(wěn)定偶聯(lián)物形成的頻率不低于但高于用19-28ζ細(xì)胞測(cè)量的頻率，并且在非裂解性偶聯(lián)物中的作用時(shí)間更長(zhǎng)。
在含有2個(gè)CAR-T細(xì)胞和1個(gè)NALM6細(xì)胞(2:1 E:T)的微孔中，19-28ζ和19-BBζ細(xì)胞的腫瘤溶解頻率均增加至約75％。
對(duì)于19-28ζ細(xì)胞，這種增加可以通過加性殺傷來解釋，但是對(duì)于19-BBζ細(xì)胞，增益超過了簡(jiǎn)單的加性效應(yīng)。這種高于預(yù)期的腫瘤殺傷符合觀察到的：2個(gè)T細(xì)胞結(jié)合于同一腫瘤細(xì)胞的偶聯(lián)物的頻率，以及第二個(gè)T細(xì)胞偶聯(lián)物靶向細(xì)胞死亡的較短時(shí)間。
使用NALM6 med和NALM6 low靶細(xì)胞的微孔研究證實(shí)并擴(kuò)展了這些結(jié)果，表明19-BBζ細(xì)胞對(duì)抗原損失比19-28ζ細(xì)胞更敏感，以及19-28ζ細(xì)胞之間隨著CD19密度降低的協(xié)同作用。
協(xié)同殺傷的可能性強(qiáng)調(diào)：靶細(xì)胞比率和基于群體的殺傷超越克隆限制的潛力。
策略二：組合靶向
上述研究提高了組合靶向治療可以減輕抗原低表達(dá)腫瘤的靶向的可能性，其已被提出用于預(yù)防抗原陰性腫瘤的免疫逃逸。
接下來，研究人員探索了組合可能性。
探索CAR-T療法的組合可能性（圖片來源：Nature）
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