通過基因工程能夠大規(guī)模生產(chǎn)生物體內(nèi)微量存在的活性物質(zhì)，并借助轉(zhuǎn)基因而改變動(dòng)植物性狀，得以在人類醫(yī)療保健中進(jìn)行基因診斷和基因治療。然而在廣泛利用自然界各種蛋白質(zhì)的過程中就發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)只是適應(yīng)生物自身的需要，而對它們進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白質(zhì)工程，它是指按照特定的需要，對蛋白質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和改造的工程。自此以后，蛋白質(zhì)工程迅速發(fā)展，已成為生物工程的重要組成部分。
蛋白質(zhì)工程首先是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和溶液構(gòu)象的研究，積累了成千上萬蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資料，并編制成系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，得以從中找出蛋白質(zhì)分子間的進(jìn)化關(guān)系、一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面的規(guī)律。特別值得指出的是，計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)和圖象顯示的迅猛發(fā)展，已使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和模型構(gòu)建，分子設(shè)計(jì)和能量計(jì)算等理論與技術(shù)以及相關(guān)軟件，正在發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的研究領(lǐng)域，而成為生物信息學(xué)的一個(gè)分支。它在蛋白質(zhì)工程定向改造的分子設(shè)計(jì)中是必不可少的條件和重要手段?！?/p>
蛋白質(zhì)作為生物大分子是生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究重點(diǎn)，大量蛋白質(zhì)被分離純化，測定了它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物學(xué)作用。分子生物學(xué)有關(guān)基因組的研究，也可以用以推測出一些未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。采用定位誘變的方法，可以對編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行核苷酸密碼子的插入、刪除、置換和改組，其結(jié)果為分子改造提供新的設(shè)計(jì)方案?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)是生物長期進(jìn)化的結(jié)果，蛋白質(zhì)工程則是對生物進(jìn)化的模擬，按照蛋白質(zhì)形成的規(guī)律，改造蛋白質(zhì)或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)?！?/p>
蛋白質(zhì)的改造通常需要先經(jīng)周密的分子設(shè)計(jì)，然后依賴基因工程獲得突變型蛋白質(zhì)，以檢驗(yàn)其是否達(dá)到了預(yù)期的效果。如果改造的結(jié)果不理想，還需要從新設(shè)計(jì)再進(jìn)行改造，往往經(jīng)歷多次實(shí)踐摸索才能達(dá)到改進(jìn)蛋白質(zhì)性能的預(yù)定目標(biāo)。
蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。三維空間結(jié)構(gòu)的測定是驗(yàn)證蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的假設(shè)即證明是新結(jié)構(gòu)改變了原有生物功能的必需手段。晶體學(xué)的技術(shù)在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有了很大發(fā)展，但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克～幾十毫克），制備出單晶體，然后再進(jìn)行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計(jì)算和分析。
另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時(shí)候要考慮到這個(gè)問題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點(diǎn)，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計(jì)算機(jī)的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動(dòng)態(tài)機(jī)理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。國外有許多研究機(jī)構(gòu)正在致力于研究蛋白質(zhì)與核酸、酶抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以開發(fā)具有高度專一性的藥用蛋白質(zhì)。
根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過分子動(dòng)力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個(gè)原子等基本原則分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預(yù)見將來能建立一套完整的理論來解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計(jì)、預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。
蛋白質(zhì)的改造，從簡單的物理、化學(xué)法到復(fù)雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學(xué)法：對蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等；生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團(tuán)或化學(xué)鍵發(fā)生作用，缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。采用基因重組技術(shù)或人工合成DNA，不但可以改造蛋白質(zhì)而且可以實(shí)現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)是由不同氨基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構(gòu)成的。氨基酸序列就是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，它決定著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質(zhì)的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的可調(diào)控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間關(guān)系之前，宜采用隨機(jī)誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標(biāo)限定在一定的區(qū)域內(nèi)，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標(biāo)DNA明確以后，就可以運(yùn)用定位突變等技術(shù)來進(jìn)行研究。
定位突變蛋白質(zhì)中的氨基酸是由基因中的三聯(lián)密碼決定的，只要改變其中的一個(gè)或兩個(gè)就可以改變氨基酸。通常是改變某個(gè)位置的氨基酸，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個(gè)階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細(xì)胞以后，通過復(fù)制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個(gè)或幾個(gè)非配對堿基）作為引物，合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。
盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)——盒式突變，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點(diǎn)，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。
PCR技術(shù)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是應(yīng)用最廣泛的基因擴(kuò)增技術(shù)。以研究基因?yàn)槟０?，用人工合成的寡核苷酸（含有一個(gè)或幾個(gè)非互補(bǔ)的堿基）為引物，直接進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，就會產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。
高突變率技術(shù)從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項(xiàng)耗時(shí)、費(fèi)力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率：①硫代負(fù)鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（α－（S）－dCTP）對某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺口”，用核苷酸外切酶III從3｀→5｀擴(kuò)大缺口并超過負(fù)鏈上錯(cuò)配的核苷酸，在聚合酶作用下修復(fù)正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；②UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產(chǎn)生的突變雙鏈轉(zhuǎn)化正常大腸桿菌，結(jié)果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負(fù)鏈保留并復(fù)制。
蛋白質(zhì)融合將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性?，F(xiàn)在研究的較多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。
提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性
葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對GI基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高10～12℃；酶比活相同。據(jù)分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一個(gè)吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于Gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。
融合蛋白質(zhì)
腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子。黎孟楓等人化學(xué)合成了EnkN端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過Naloxone競爭阻斷實(shí)驗(yàn)證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。
蛋白質(zhì)活性的改變
通常飯后30～60min，人血液中胰島素的含量達(dá)到高峰，120～180min內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120min后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180～240min，與人生理狀況不符。實(shí)驗(yàn)表明，胰島素在高濃度（大于10－5mol/L）時(shí)以二聚體形式存在，低濃度時(shí)（小于10－9mol/L）時(shí)主要以單體形式存在。設(shè)計(jì)速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子－I(IGF－I)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但I(xiàn)GF－I不形成二聚體。IGF－I的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對應(yīng)）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實(shí)驗(yàn)。
治癌酶的改造
癌癥的基因治療分二個(gè)方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)正常細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。皰癥病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可以催化胸腺嘧啶和其他結(jié)構(gòu)類似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR無環(huán)鳥苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3｀端羥基，就可以終止DNA的合成，從而殺死癌細(xì)胞。HSV－TK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機(jī)突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個(gè)氨基酸被替換，催化能力分別提高43和20倍。O6－烷基－鳥嘌呤是DNA經(jīng)烷基化劑（包括化療用亞硝基藥物）處理以后形成的主要誘變劑和細(xì)胞毒素，所以這些亞硝基藥物的使用劑量受到限制。O6－烷基－鳥嘌呤－DNA烷基轉(zhuǎn)移酶O6－Alkylguanine－DNAalkyltransferase(AGT)能夠?qū)ⅧB嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保護(hù)作用。通過反向病毒轉(zhuǎn)染，人類AGT在鼠骨髓細(xì)胞中表達(dá)并起到保護(hù)作用。通過突變處理，得到一些正突變AGT基因且活性都比野生型的高，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。
嵌合抗體和人緣化抗體
免疫球蛋白呈Y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)（N端）和恒定區(qū)（C端），抗原的吸附位點(diǎn)在可變區(qū)，細(xì)胞毒素或其他功能因子的吸附位點(diǎn)在恒定區(qū)。每個(gè)可變區(qū)中有三個(gè)部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在β折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)（CDR），是抗原的結(jié)合位點(diǎn)，其余部分為CDR的支持結(jié)構(gòu)。不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過蛋白質(zhì)工程對抗體進(jìn)行改造。
鼠單克隆抗體被人免疫系統(tǒng)排斥，它潛在的治療作用得不到利用。嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的單克隆抗體Mab17－1A。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問題，但仍有幾種嵌合抗體通過了臨床實(shí)驗(yàn)。所謂人緣化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將CDR轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個(gè)框架氨基酸殘基，才能保持原有的吸附力。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個(gè)氨基酸替代或計(jì)算機(jī)模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎(chǔ)之上，盡可能地降低免疫原性。第一個(gè)臨床上應(yīng)用的用于治療淋巴肉芽腫病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人緣化抗體CAMPATH－1H，盡管療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應(yīng)。而其他人緣化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應(yīng)可以忽略不計(jì)。
