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     從工業(yè)微生物育種史來看，誘變育種曾取得了巨大的成就，使微生物有效產(chǎn)物成百倍、乃致成千倍的增加。但是誘變育種工作量繁重，盲目性大。近年來由于應(yīng)用生物化學(xué)和遺傳學(xué)原理，深入研究了生物合成代謝途徑以及代謝調(diào)節(jié)控制的基礎(chǔ)理論，人們不僅可進(jìn)行外因控制，通過培養(yǎng)條件來解除反饋調(diào)節(jié)而使生物合成的途徑朝著人們所希望的方向進(jìn)行，即實(shí)現(xiàn)代謝控制發(fā)酵；同時(shí)還可進(jìn)行內(nèi)因改變，通過定向選育某種特定的突變型，以達(dá)到大量積累有益產(chǎn)物的目的，即所謂代謝控制育種。內(nèi)因是變化的根據(jù)，所以改變微生物的遺傳型往往是控制代謝的更為有效的途徑。代謝控制育種可以大大減少傳統(tǒng)育種的盲目性，提高了效率。代謝控制育種很快在初級(jí)代謝產(chǎn)物的育種中得到廣泛的應(yīng)用，成就也十分顯赫，幾乎全部氨基酸和多種核苷酸生產(chǎn)菌株都被打上了抗性或缺陷型遺傳標(biāo)記。

     代謝調(diào)節(jié)控制育種通過特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累方向進(jìn)行。

 

克服反饋調(diào)節(jié)，可從以下兩方面著手：降低末端產(chǎn)物濃度；應(yīng)用抗反饋突變株

 

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的代謝流受阻，末端產(chǎn)物減少，解除了末端產(chǎn)物參與的反饋調(diào)節(jié)，可使代謝途徑中的某一中間產(chǎn)物積累。一個(gè)典型的例子是谷氨酸棒狀桿菌的精氨酸缺陷型突變株進(jìn)行鳥氨酸發(fā)酵(，由于合成途徑中酶6(氨基酸甲酰轉(zhuǎn)移酶)的缺陷，必須供應(yīng)精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長(zhǎng)，但是這種供應(yīng)要維持在亞適量水平，使菌體達(dá)到最高生長(zhǎng)，又不引起終產(chǎn)物對(duì)酶② (N—乙酰谷氨酸激酶)的反饋抑制，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。

 

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變導(dǎo)致協(xié)同反饋調(diào)節(jié)某一分支途徑的代謝阻斷，使這一分支途徑的終產(chǎn)物不能合成。若控制供應(yīng)適量的這一終產(chǎn)物，滿足微生物生長(zhǎng)，將使合成代謝流向另一分支途徑，有利于另一終產(chǎn)物的大量積累。例如，谷氨酸棒桿菌生物素缺陷型是以葡萄糖或醋酸作為碳源，棒狀桿菌經(jīng)誘變處理后，基因發(fā)生突變，不能合成相應(yīng)的酶，導(dǎo)致乙酰輔酶A和生物素之間的合成反應(yīng)受到阻斷，切斷了支路代謝，代謝只能向著谷氨酸合成方向進(jìn)行，因而產(chǎn)量得到累積。又如硫胺素缺陷型是在α-酮戊二酸與硫胺素之間的反應(yīng)發(fā)生阻斷，也使谷氨酸產(chǎn)量大幅度增加。又如次黃嘌呤核苷酸產(chǎn)生菌，是棒桿菌和短桿菌的腺嘌呤缺陷型菌株，其合成途徑中酶③失活，控制限量補(bǔ)給腺核苷酸，可解除腺核苷對(duì)酶①的反饋調(diào)節(jié)，由于腺核苷酸和鳥核苷酸對(duì)酶①協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，故代謝流偏向鳥苷酸這一分支途徑

 

工業(yè)上應(yīng)用的重要例子是賴氨酸發(fā)酵。我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)賴氨酸曾是一株高絲氨酸缺陷型菌株，由生產(chǎn)谷氨酸北京棒狀桿菌ASl．299ASl 299經(jīng)硫酸二乙酯處理后獲得的。從圖8．24可知，蘇氨酸、高絲氨酸、

賴氨酸的前體是天冬氨酰半縮醛，誘變后，促使高絲氨酸脫氫酶的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致合成高絲氨酸的代謝途徑阻斷，消除了蘇氨酸和賴氨酸天冬氨酰激酶的協(xié)同反饋抑制，因而天冬酰半縮醛由原來負(fù)責(zé)合成3個(gè)氨基酸而代謝流完全導(dǎo)向賴氨酸方向進(jìn)行，使賴氨酸產(chǎn)量大量累積。

 

滲漏缺陷型是一種不完全營(yíng)養(yǎng)缺陷型，它不會(huì)產(chǎn)生過量的末端產(chǎn)物，因而可以避開反饋調(diào)節(jié)。但它又能合成微量的末端產(chǎn)物，用來進(jìn)行生物合成；在培養(yǎng)這種突變體時(shí)，可不必在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的物質(zhì)，就能積累所需的產(chǎn)物。

 

細(xì)胞內(nèi)合成的發(fā)酵產(chǎn)物若要分泌到培養(yǎng)基中，必須經(jīng)過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。如果產(chǎn)物不易分泌出細(xì)胞，而積累在細(xì)胞內(nèi)，則會(huì)引起反饋調(diào)節(jié)。改變細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性，使其有利于產(chǎn)物的分泌，也是降低末端產(chǎn)物濃度的一種途徑。谷氨酸生產(chǎn)菌的細(xì)胞膜磷脂含量高時(shí)，細(xì)胞的通透性較差，磷脂含量低時(shí)，通透性較好。

 

在以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果代謝途徑單一無分支，往往不能選用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。要提高產(chǎn)量，最好采用抗反饋突變株?？狗答佂蛔冎暧捎诨蛲蛔?，它們的酶或無活性的原阻遏物不再與末端產(chǎn)物結(jié)合，從而不再發(fā)生酶的變構(gòu)及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再與發(fā)生了突變的操縱基因結(jié)合，因此反饋調(diào)節(jié)被打破，即使在末端產(chǎn)物過量的情況下，也同樣可以積累高濃度的末端產(chǎn)物。

 

抗反饋突變株通?？梢杂锰砑幽┒水a(chǎn)物類似物的方法來篩選。末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細(xì)胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。那些對(duì)類似物不敏感的突變體，則由于原來受反饋控制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了改變，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產(chǎn)物。例如，用類似物D-精氨酸選出的谷氨酸棒桿菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產(chǎn)量得到提高。

 

生產(chǎn)中要克服分解代謝阻遏可采取下列措施：

可采用相對(duì)來說不引起分解代謝阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有機(jī)酸和黃豆餅粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培養(yǎng)熒光假單胞菌，由于克服了半乳糖的分解代謝阻遏，結(jié)果在細(xì)胞中所產(chǎn)生的纖維素酶提高了1500倍。

 

在考慮經(jīng)濟(jì)效益而必須使用有阻遏作用的碳源或氮源時(shí)，緩慢流加碳、氮源可使分解代謝產(chǎn)物維持在較低的水平上，而不至于產(chǎn)生阻遏。

 

篩選方法：在以酶受阻遏的底物為唯一氮源的培養(yǎng)基上，選擇能正常生長(zhǎng)的菌落。

 

在生產(chǎn)上為了提高誘導(dǎo)酶的產(chǎn)量，對(duì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)控制的常用手段有：

 

1、添加誘導(dǎo)物類似物：在誘導(dǎo)物就是酶的底物的情況下，添加底物類似物來加強(qiáng)誘導(dǎo)作用是最好的。因?yàn)榈孜镱愃莆锊灰妆凰纬傻拿阜纸?，而在?xì)胞中始終保持較高的濃度，能夠持續(xù)地誘導(dǎo)酶的合成，獲得較高濃度的酶。

2、添加輔酶或輔助因子：在有些情況下，必須在培養(yǎng)基中添加輔酶才會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。例如：丙酮酸脫羧酶的合成需有硫胺存在。

3、利用組成型突變株：選育組成型突變株的方法，其主要原則是創(chuàng)造一種利于組成型菌株生長(zhǎng)而不利于誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，造成對(duì)組成型的選擇優(yōu)勢(shì)以及適當(dāng)?shù)淖R(shí)別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。