工業(yè)微生物菌種的選育——誘變選育（1）來(lái)源：青島海博 |
| 優(yōu)良菌株的選育的目的是防止菌種退、解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題、提高產(chǎn)品質(zhì)量和開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品。選育的方法主要有基于基因突變的自然選育和誘變育種以及基于基因重組的雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程等。 誘變選育 誘變育種是指利用各種誘變劑的物理因素和化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。誘變育種具有速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法，使用普遍。誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。 誘變育種的步驟與方法 （一）、工業(yè)育種的一般步驟（圖） （二）、誘變育種方案設(shè)計(jì) 誘變育種方案包括突變的誘發(fā)、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)。 1、出發(fā)菌株的選擇 工業(yè)上用來(lái)進(jìn)行誘變處理的菌株，稱(chēng)為出發(fā)菌株。出發(fā)菌株選擇目前主要依據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)如下： ①以單倍體純種為出發(fā)菌株； ②采用具有優(yōu)良性狀的菌株；③選擇對(duì)誘變劑敏感的菌株；④許多高產(chǎn)突變往往要經(jīng)過(guò)逐步累積的過(guò)程，才變得明顯，所以有必要多挑選一些已經(jīng)過(guò)誘變的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行多步育種，確保高產(chǎn)菌株的獲得。 2、出發(fā)菌株的純化 為什么要對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行純化呢？這是因?yàn)槲⑸锶菀装l(fā)生變異和染菌，同時(shí)一般絲狀菌的野生菌株多為異核體。生產(chǎn)菌在不斷移代過(guò)程中，菌絲間接觸、吻合后，易產(chǎn)生異核體、部分結(jié)合子、雜合二倍體及自然突變株等。這些都會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的異質(zhì)化，使遺傳性狀不穩(wěn)定。通過(guò)純種分離，從中挑選所需的優(yōu)良菌株。常用劃線分離和稀釋分離法，并結(jié)合顯微鏡操縱器分離單孢子。 3、單孢子懸液的制備 誘變育種要求所處理的細(xì)胞必須是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期同步生長(zhǎng)的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。 首先是細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變處理也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，如細(xì)菌在對(duì)數(shù)期誘變處理效果較好；霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率。 其次是分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長(zhǎng)出不純菌落。由于在許多微生物的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有幾個(gè)核，所以即使用單細(xì)胞懸浮液處理，還是容易出現(xiàn)不純的菌落。若誘變劑產(chǎn)生的突變只在 DNA雙鏈中的某一條單鏈，故該突變無(wú)法反映在當(dāng)代的表型上。只經(jīng)過(guò)DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂，表型才會(huì)發(fā)生變異，出現(xiàn)不純菌落，這就叫表型延遲 (phenotypic lag) 。不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀 “衰退”的主要原因。 （1）供試菌株的孢子或菌體的選擇 供試細(xì)胞要新培養(yǎng)的，細(xì)胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的對(duì)數(shù)期，這樣突變率高，重現(xiàn)性也好。對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，常常通過(guò)前培養(yǎng)達(dá)到要求。菌懸液中的菌體應(yīng)該是單細(xì)胞或單核的孢子，不但能均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現(xiàn)象發(fā)生。在實(shí)際工作中，要得到均勻分散的細(xì)胞懸液，通?？捎脽o(wú)菌的玻璃珠來(lái)打散成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉或?yàn)V紙過(guò)濾。 菌懸液的細(xì)胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細(xì)胞 10 6 ~ 10 7 個(gè)/ml，放線菌或細(xì)菌10 8 個(gè)/ml。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。有時(shí)，也需用0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋?zhuān)驗(yàn)橛行┗瘜W(xué)誘變劑處理時(shí)，常會(huì)改變反應(yīng)液的pH值。 （2）菌懸液制備方法 細(xì)菌：在誘變處理前進(jìn)行搖瓶振蕩培養(yǎng)，利用溫度和碳源控制其同步生長(zhǎng)，離心洗滌，用冷生理鹽水或緩沖液制備菌懸液，放在有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)振蕩10min，用無(wú)菌脫脂棉或?yàn)V紙過(guò)濾，通過(guò)菌體計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度。孢子：在試驗(yàn)中盡量采用成熟而成熟的孢子，并置于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到孢子剛萌發(fā)，即芽長(zhǎng)相當(dāng)孢子直徑0.5－1倍。離心洗滌，加入生理鹽水或緩沖液，振蕩打碎孢子團(tuán)塊，以脫脂棉過(guò)濾，計(jì)數(shù)，調(diào)整菌體濃度供誘變處理。對(duì)不產(chǎn)孢的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理。 4、誘變劑的種類(lèi)和選擇 A、誘變劑種類(lèi)的選擇 物理誘變劑包括：各種射線，如紫外線（焦耳）、X射線（庫(kù)侖/千克）、β射線、γ射線、α射線和超聲波等；化學(xué)誘變劑包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。 選擇誘變劑要根據(jù)誘變劑作用機(jī)制，結(jié)合菌種特性來(lái)考慮選擇哪種誘變劑 ，同時(shí)要考慮菌種特性和遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)還要參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來(lái)選擇誘變劑。對(duì)遺傳穩(wěn)定的菌株，最好采用以前未使用過(guò)的、突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理。對(duì)遺傳不穩(wěn)定的菌株，首先進(jìn)行自然分離，劃分菌落類(lèi)型，從中選擇效價(jià)高的、性能好的一類(lèi)菌落作為誘變處理的出發(fā)菌株。采用溫和誘變劑或?qū)υ擃?lèi)菌劑進(jìn)行繼續(xù)處理，從中篩選突變體。并結(jié)合自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類(lèi)型不斷增加，成為正常型菌落。在誘變之前還要考查出發(fā)菌株的誘變系譜，詳細(xì)分析，總結(jié)規(guī)律性，選擇一種最佳的誘變劑。 B、最適誘變劑量的選擇 誘變的最適劑量，應(yīng)該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大比例，這樣可減少以后的篩選工作。 要確定一個(gè)合適的劑量，通常要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)。就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達(dá)到一定劑量后，再提高劑量會(huì)使誘變頻率下降。根據(jù)對(duì)紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負(fù)突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。例如，過(guò)去在用紫外線作誘變劑時(shí)，常采用殺菌率為90—99.9%的劑量，而近年來(lái)則傾向于采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對(duì)于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此。 化學(xué)誘變劑主要是調(diào)節(jié)濃度、處理時(shí)間和處理?xiàng)l件（溫度、pH等）。物理誘變劑主要控制照射距離、時(shí)間和照射過(guò)程中的條件（氧、水等），以達(dá)到最佳的誘變效果。 5、誘變處理 A、不同誘變處理方法 （1）紫外線照射 由于紫外線不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。 紫外線誘變育種的原理是：紫外線是波長(zhǎng)短于紫色可見(jiàn)光而又緊接紫色光的射線、波長(zhǎng)范圍為136～300nm，紫外線波長(zhǎng)范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個(gè)小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長(zhǎng)集中在265nm處，對(duì)應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當(dāng)物質(zhì)吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會(huì)激發(fā)，不會(huì)產(chǎn)生任何化學(xué)變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對(duì)于DNA的變化起主要作用。 紫外線誘變方法：將10mL菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動(dòng)磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時(shí)間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準(zhǔn)確起見(jiàn)，照射前紫外燈應(yīng)先預(yù)熱20~30min，然后再進(jìn)行處理。 不同的微生物對(duì)于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對(duì)于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時(shí)間，這樣可以設(shè)計(jì)一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝俊?/div> 一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來(lái)也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認(rèn)為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時(shí)則負(fù)突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向采用低劑量、長(zhǎng)時(shí)間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。 實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了避免光復(fù)活現(xiàn)象，處理過(guò)程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來(lái)培養(yǎng)，然后再進(jìn)行分離篩選。 （2）CO60 照射 CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線劑量直接有關(guān)，而與時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導(dǎo)致堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對(duì)嘧啶的作用更強(qiáng)，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對(duì)C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。 一般照射時(shí)多采用菌懸液，也可用長(zhǎng)了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬(wàn)倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。 （3）等離子輸入 等離子輸入是一種較新的誘變方法，國(guó)外自20世紀(jì)60年代中、后期相繼開(kāi)始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究，國(guó)內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所于1986年開(kāi)創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，既有能量的沉積、動(dòng)量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和膜電場(chǎng)的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時(shí)，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時(shí)還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對(duì)生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過(guò)這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強(qiáng)烈影響生物細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。 B、不同誘變處理方式 ①單一因子處理：采用單一誘變劑處理，可以減少減少菌種遺傳背景復(fù)雜化、菌落類(lèi)型分化過(guò)多的弊病，使篩選工作趨向簡(jiǎn)單化。 ②復(fù)合因子處理：指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。適合于遺傳性穩(wěn)定的純種及生活能力強(qiáng)的菌株處理，能導(dǎo)致較大的突變。主要有：兩個(gè)以上因子同時(shí)處理；不同誘變劑交替處理；同一種誘變劑連續(xù)重復(fù)使用；紫外線復(fù)活交替處理。 |
