| 導(dǎo)讀 | 科學(xué)家利用CRISPR-Cas系統(tǒng)可對(duì)多種來源的細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯。其中CRISPR-Cas RGN是一種組成較簡(jiǎn)單的CRISPR-Cas系統(tǒng)，簡(jiǎn)單易用且特異性高。但一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas RGN在人類細(xì)胞中也會(huì)導(dǎo)致脫靶突變。 |
在過去一年中，一種叫做CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯工具在科學(xué)界引起了極大的關(guān)注。 CRISPR-Cas系統(tǒng)是在大多數(shù)細(xì)菌以及古菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫系統(tǒng)，可用來對(duì)抗病毒以及其他病原體對(duì)細(xì)菌的入侵?？茖W(xué)家利用CRISPR-Cas系統(tǒng)可以對(duì)多種細(xì)胞的特定的基因組位點(diǎn)上進(jìn)行切割，以便插入新的遺傳物質(zhì)。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有三種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，其中其中第二型的組成較為簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白以及向?qū)NA（guidance RNA）為核心，即CRISPR-Cas RNA引導(dǎo)核酸酶（CRISPR-Cas RNA-guided nuclease，CRISPR-Cas RGN）。不過，最近來自美國(guó)麻省總醫(yī)院的研究者發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas RGN也存在重大的局限性，它會(huì)在基因組的非目標(biāo)位置產(chǎn)生非必要的DNA突變，也就是脫靶效應(yīng)（off-target effect）。
Cas9通過向?qū)NA結(jié)合之目標(biāo)DNA上并進(jìn)行切割（切割點(diǎn)：紅色X）
這項(xiàng)最新的研究發(fā)現(xiàn)在線發(fā)表在最新一期的Nature Biotechnology上，研究的共同作者、麻省總醫(yī)院病理學(xué)系的J. Keith Joung博士表示：“我們很驚訝地發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas RGN在人類細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)?！彼硎綬GN相比其他的基因組編輯技術(shù)具有巨大的優(yōu)勢(shì)，但是這一新的發(fā)現(xiàn)將促使研究者去改善這一工具的精準(zhǔn)性。
CRISPR-Cas RGN由DNA切割酶Cas9以及一條含20個(gè)核苷酸的RNA短鏈（作用是與目標(biāo)DNA鏈匹配）組成。CRISPR-Cas RGN模擬的正是一些特定細(xì)菌的原始免疫系統(tǒng)。當(dāng)這些微生物受病毒或其他生物感染時(shí)，它們會(huì)拷貝入侵者的一段遺傳編碼并整合至自己的DNA中，并遺傳給下一代。當(dāng)子代細(xì)菌再次遭遇這些入侵者時(shí)，細(xì)菌的Cas9在與所整合DNA匹配的RNA鏈的向?qū)拢谌肭终逥NA的目標(biāo)位置進(jìn)行切割，從而使病原體失活。
大約一年前，科學(xué)家首次報(bào)道了利用重編程的CRISPR-CAS RGN靶定并切割特定的DNA位點(diǎn)。此后，不少的研究團(tuán)隊(duì)成功地利用CRISPR-Cas RGN對(duì)果蠅、斑馬魚、小鼠以及人類細(xì)胞——包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行了基因組編輯。該技術(shù)依靠短鏈RNA片段對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行靶定，使其相比其他的基因編輯工具，如ZFN、TALEN等均簡(jiǎn)單易用，并且RGN經(jīng)過改造后可同時(shí)在一個(gè)基因組中引入多個(gè)遺傳改變。生物探索網(wǎng)站在5月份還介紹過MIT懷特黑德研究所Rudolf Jaenisch教授的研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas技術(shù)一次性構(gòu)建多突變轉(zhuǎn)基因鼠。
但是，CRISPR-Cas RGN可導(dǎo)致額外而非需要的遺傳改變的可能性則較少被研究過。因此Joung博士的團(tuán)隊(duì)決定對(duì)CRISPR-Cas RGN在人類細(xì)胞中的脫靶現(xiàn)象進(jìn)行研究。由于CRISPR-Cas RGN的指導(dǎo)RNA片段與目標(biāo)DNA只依賴于20個(gè)核苷酸進(jìn)行匹配，因而他們推測(cè)這段RNA有可能也會(huì)與目標(biāo)外的其他片段發(fā)生結(jié)合。
盡管過往的研究表明，即便是一個(gè)核苷酸的錯(cuò)配都可以阻止CRISPR-Cas RGN繼續(xù)發(fā)揮作用，但是麻省總醫(yī)院的這項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)，在人類細(xì)胞系中，多達(dá)5個(gè)核苷酸的錯(cuò)配都未必阻止目標(biāo)位點(diǎn)外的切割。他們還發(fā)現(xiàn)，脫靶位點(diǎn)的突變率與目標(biāo)位點(diǎn)的突變率相同甚至更高，而這中現(xiàn)象未見于ZFN和TALEN技術(shù)。
“我們的研究結(jié)果并不是說RGN不是一個(gè)重要的研究工具，而是說研究人員需要考慮他們實(shí)驗(yàn)中的這些潛在的令人混淆的影響。這些結(jié)果也表明現(xiàn)有的RGN平臺(tái)可能還不可用于治療應(yīng)用，” Joung博士說?！拔覀儸F(xiàn)在正在研究減少這些脫靶效應(yīng)的方法，以及用于尋找任何RGN在人類細(xì)胞中所有可能的脫靶位點(diǎn)的方法，借此我們可以對(duì)所有二代的RGN平臺(tái)進(jìn)行評(píng)估，看是否會(huì)更加精確。我很樂觀地認(rèn)為我們可以對(duì)這套系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)，使其更具特異性，從而有望用于人類疾病治療。”
Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) RNA-guided nucleases (RGNs) have rapidly emerged as a facile and efficient platform for genome editing. Here, we use a human cell–based reporter assay to characterize off-target cleavage of CRISPR-associated (Cas)9-based RGNs. We find that single and double mismatches are tolerated to varying degrees depending on their position along the guide RNA (gRNA)-DNA interface. We also readily detected off-target alterations induced by four out of six RGNs targeted to endogenous loci in human cells by examination of partially mismatched sites. The off-target sites we identified harbored up to five mismatches and many were mutagenized with frequencies comparable to (or higher than) those observed at the intended on-target site. Our work demonstrates that RGNs can be highly active even with imperfectly matched RNA-DNA interfaces in human cells, a finding that might confound their use in research and therapeutic applications.
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