自組裝（self-assembly）是將基本分子單元組成功能性納米結(jié)構(gòu)的一種有力工具，在光學(xué)傳感和控制藥物遞送等方面發(fā)揮著重要作用。分子自組裝主要由各種弱且可逆的非共價(jià)相互作用力驅(qū)動，包括靜電相互作用（electrostatic interactions）、π-π堆積作用（π-π stacking）、范德華力（Van der Waals interactions）以及疏水效應(yīng)（hydrophobic effects）。然而，復(fù)雜多變的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境經(jīng)常破壞自組裝納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，如何在活體中構(gòu)建可逆自組裝系統(tǒng)仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。
近日，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院劉定斌研究員課題組設(shè)計(jì)合成了一種以疏水性金納米顆粒（AuNP）為核心、pH響應(yīng)型染料摻雜的共聚物為外殼的可逆自組裝系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)共聚物和AuNP的分子間作用力來精確控制可逆裝配-拆卸過程。相關(guān)成果以“Reversible Self-Assembly of Nanoprobes in Live Cells for Dynamic Intracellular pH Imaging”為題發(fā)表于ACS Nano（DOI: 10.1021/acsnano.8b07054）。
首先，作者通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）反應(yīng)合成了一系列pH響應(yīng)型嵌段共聚物。這些共聚物由親水性聚乙二醇（PEG）鏈和帶有叔胺（二戊胺（DPA），二異丙胺（DiPA）和環(huán)六亞甲基亞胺（HA））的疏水性嵌段組成，并綴合pH不敏感的Cy5染料作為成像信標(biāo)。隨后，作者使用十二烷硫醇覆蓋AuNP，使NP核疏水，從而引發(fā)共聚物自組裝到AuNP上（圖1a）。UV-vis光譜分析結(jié)果顯示，AuNP的特征吸收帶從525 nm紅移至535 nm，且在600 nm左右出現(xiàn)Cy5的吸收帶。AuNP具有高的熒光淬滅效率，當(dāng)Cy5非常接近AuNP表面時(shí)，其表面熒光被有效淬滅（圖1b）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像清晰地顯示出納米組件的核-殼結(jié)構(gòu)，其中圍繞AuNP核的有機(jī)層厚度約為3 nm（圖1c）。接著，作者考察了該納米組件的拆卸行為。作者將溶液調(diào)節(jié)為酸性時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cy5的熒光強(qiáng)度顯著增加，這說明共聚物已從AuNP中釋放出來。產(chǎn)生該現(xiàn)象的主要原因是：酸性條件下，DiPA基團(tuán)帶正電荷，減弱了其與十二烷硫醇覆蓋的AuNP核心的疏水作用。作者進(jìn)一步用DPA和HA分別與四甲基羅丹明（TMR）和Cy7.5染料綴合，同樣證明了pH依賴型的納米組件的裝配和拆卸過程。令人驚喜的是，三種納米組件在不同pH值下均顯示出明顯的熒光躍遷（圖1e）。為了定量評估pH響應(yīng)性質(zhì)，作者通過比率（F-Fmin）/（Fmax-Fmin）將熒光強(qiáng)度歸一化，其中F是在期望pH值下的熒光強(qiáng)度，而Fmax和Fmin是完全恢復(fù)熒光和熒光淬火狀態(tài)的熒光強(qiáng)度。極小的ΔpH10-90％值（標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度的pH范圍從10％到90％變化）充分證明了納米組件對pH變化的高度敏感性（圖1f）。
（來源：ACS Nano）
接著，作者進(jìn)行了納米組件裝配-拆卸過程的分子動力學(xué)模擬研究。為了降低計(jì)算成本，作者將共聚物的分子結(jié)構(gòu)簡化為三個DiPA共軛PEG的重復(fù)單元。模擬結(jié)果顯示，當(dāng)pH>6.2時(shí)，共聚物吸附在AuNP表面，DiPA鏈段錨定在十二烷硫醇部分中；當(dāng)pH<6.2時(shí)，共聚物從AuNP上拆卸，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致（圖2a）。隨后，作者通過計(jì)算單個DiPA和AuNP表面之間的自由能探究了兩者的相互作用力（圖2b），并發(fā)現(xiàn)非質(zhì)子化的DiPA（pH>6.2）比質(zhì)子化的DiPA（pH<6.2）更易結(jié)合在AuNP表面，這表明非質(zhì)子化的DiPA和AuNP之間具有更強(qiáng)的相互作用力。兩個DiPA之間相互作用的自由能曲線表明兩個質(zhì)子化的DiPA之間存在明顯的排斥作用（圖2d），且明顯強(qiáng)于DiPA和AuNP間的吸引力（圖2c）。因此，pH引發(fā)的拆卸歸因于質(zhì)子化DiPA鏈段和疏水性AuNP表面的弱相互作用，以及酸性條件下質(zhì)子化DiPA之間的強(qiáng)排斥作用。更進(jìn)一步，作者用Gaussian 09程序計(jì)算了不同狀態(tài)下DiPA的靜電勢（ESP），結(jié)果與自由能的計(jì)算結(jié)果高度一致（圖2e）。
（來源：ACS Nano）
基于叔胺（TA）基團(tuán)可逆電離的性質(zhì)，作者通過改變?nèi)芤旱膒H值可逆地控制裝配-拆卸過程。在pH為6.0-7.4的條件下，納米組件的熒光分別恢復(fù)和淬滅三次（圖3a和3b），這表明其裝配-拆卸過程的可逆性。接著，作者探究了蛋白質(zhì)是否影響其重組過程。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)在很大程度上影響共聚物重組成納米顆粒的過程（圖3c），但并不影響基于AuNP的共聚物的重組（圖3d）?？上驳氖牵簿畚锱cAuNP和模型蛋白BSA的結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致（圖3e和3f）。以上結(jié)果表明，共聚物與AuNP具有更高的親和力。
（來源：ACS Nano）
基于良好的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者將納米組件運(yùn)用于監(jiān)測不同細(xì)胞器的pH變化。首先用PEG-b-(PDiPA-r-Cy5)修飾的AuNP和PEG-b-(PDPA-r-TMR)修飾的AuNP分別與具有靶向作用的RGD形成的共聚物組裝形成探針pHt 6.2和pHt 4.4。作者將這兩種探針與HepG2細(xì)胞一起孵育，并通過共聚焦顯微鏡記錄成像結(jié)果。探針進(jìn)入細(xì)胞后被激活，4小時(shí)內(nèi)，Cy5和TMR通道的熒光信號逐漸恢復(fù)，而孵育5-7小時(shí)后，熒光信號逐漸減弱（圖4）。作者推測，可逆的pH響應(yīng)型熒光激活-淬滅可能是由聚合物可逆組裝至AuNP核心造成的，這一推測可通過細(xì)胞切片的TEM成像得到驗(yàn)證。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，納米探針在細(xì)胞內(nèi)主要?dú)v經(jīng)胞吞-胞吐循環(huán)。在細(xì)胞內(nèi)，納米探針首先遇到酸性初級內(nèi)體（pH=6.0-6.5），接著轉(zhuǎn)運(yùn)至次級內(nèi)體/溶酶體（pH=4.0-5.5），最后運(yùn)輸?shù)礁郀柣w等細(xì)胞器（pH=7.4）。
（來源：ACS Nano）
最后，作者研究了探針在細(xì)胞內(nèi)從初級內(nèi)體到次級內(nèi)體/溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。作者用綠色熒光蛋白（GFP）融合的Rab5a和Lamp1生物標(biāo)記物轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，相應(yīng)的生物標(biāo)志物可分別特異性地識別初級內(nèi)體和次級內(nèi)體/溶酶體。隨后，作者將GFP染色的細(xì)胞與探針共同孵育，并通過共聚焦成像進(jìn)行探針與特定細(xì)胞器的共定位分析。分析結(jié)果表明，探針pHt 6.2在4小時(shí)內(nèi)仍停留在初級內(nèi)體，而其它探針逐漸在次級內(nèi)體/溶酶體中進(jìn)一步活化（圖5a）。探針pHt 6.2在6小時(shí)后從初級內(nèi)體完全轉(zhuǎn)移至次級內(nèi)體/溶酶體，而其它探針已轉(zhuǎn)移到高爾基體等細(xì)胞器。相反，探針pHt 4.4于2小時(shí)內(nèi)在初級內(nèi)體和次級內(nèi)體/溶酶體中均保持“沉默”，孵育4小時(shí)后，探針pHt 4.4的熒光逐漸恢復(fù)。這些結(jié)果表明，盡管兩種pH探針可以進(jìn)入相同的區(qū)室，但它們的熒光激活行為是不同的。基于上述研究結(jié)果，作者提出兩種探針在不同細(xì)胞器內(nèi)的動態(tài)拆卸-重組過程。進(jìn)入細(xì)胞后，探針pHt 6.2中的pH響應(yīng)型聚合物可以快速釋放到初級內(nèi)體中，當(dāng)探針進(jìn)入次級內(nèi)體/溶酶體時(shí)，分解過程達(dá)到飽和。相反，探針pHt 4.4的分解過程僅在次級內(nèi)體/溶酶體中發(fā)生。當(dāng)探針轉(zhuǎn)移到高爾基體等細(xì)胞器時(shí)，釋放的聚合物重新組裝到AuNP表面上，再次發(fā)生熒光淬滅（圖5c）。
（來源：ACS Nano）
總而言之，作者設(shè)計(jì)合成了一系列pH響應(yīng)型共聚物，該類共聚物在水溶液中能可逆地組裝至AuNP核心上以構(gòu)建納米組件。裝配和拆卸過程由TA基團(tuán)的可逆質(zhì)子化引發(fā)，并通過調(diào)節(jié)共聚物和AuNP核之間的相互作用力得以實(shí)現(xiàn)。該納米組件有如下優(yōu)點(diǎn)：1. 可在生理?xiàng)l件下進(jìn)行可逆裝配-拆卸；2. AuNP作為自組裝模板的同時(shí)還是良好的熒光淬滅劑；3. AuNP上極少的共聚物仍可以用于生物成像；4. 納米組件對pH具有高度敏感性；5. 納米組件的pHt值可調(diào)節(jié)。這些pH響應(yīng)型納米組件的發(fā)現(xiàn)將有助于跟蹤活細(xì)胞中納米顆粒的運(yùn)輸過程，并可應(yīng)用于生物和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
