很久很久以前，非編碼家族有個同門師兄弟—大師兄lncRNAs，小師弟miRNA，有一天他們愛上了同一個姑娘mRNA,然而這個姑娘更喜歡大師兄，于是小師弟心生妒忌將其囚禁……
咳咳，小編最近迷上了武俠劇，一不小心就入戲了。言歸正傳，今天為大家分享一篇近期發(fā)表在Molecular Cancer雜志（IF:7.776）中一篇lncRNAs通過作為miRNA的競爭性RNA（ceRNA）的相關研究，文獻鏈接地址：https://doi.org/10.1186/s12943-018-0870-5。
首先介紹下文章背景：
卵巢癌是世界上最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，死亡率高。由于早期難以發(fā)現(xiàn)，因此大多數(shù)卵巢癌易發(fā)生轉移。
研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質轉化（EMT）在腫瘤細胞轉移中起關鍵作用。而轉化生長因子-β信號通路（TGF-β）是其主要誘導因子，除此之外TGF-β也可通過激活ZEB1，ZEB2，SNAI1，SNAI2，TWIST1和TWIST2等多種轉錄因子進而直接或者間接抑制E-cadherin 的啟動子。
迄今為止，大量非編碼RNA（ncRNA）已被發(fā)現(xiàn)參與控制基因表達和激活途徑，包括EMT過程的激活和抑制，進而參與癌癥和其他疾病的發(fā)展。此外，許多研究表明lncRNAs通過作為miRNA的競爭性RNA（ceRNA）在腫瘤發(fā)生，侵襲，轉移和耐藥性中發(fā)揮關鍵作用。
在本篇研究中，作者在間質亞型卵巢癌中構建了一個lncRNA介導的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡，作者假設PTAR可能作為 miR-101的競爭性內(nèi)源性lncRNA起作用，進而調(diào)控TGF-β誘導的EMT現(xiàn)象，參與 OvCa的侵襲-轉移過程。
----------------正文解讀----------------
一：作者運用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)卵巢癌的iM亞型特異性ceRNA網(wǎng)絡：包含7個miRNA，14個lncRNA和12個EMT相關編碼基因。根據(jù)ceRNA的假設，EMT基因和miRNA的表達以及l(fā)ncRNA和miRNA應呈現(xiàn)負相關。于是作者確定研究ceRNA對-ZEB1，miR-101-3p和lncRNA AP000695.4：間質化OvCa亞型樣品中ZEB1顯著上調(diào)，與lncRNA AP000695.4（PTAR）的表達水平正相關，與miR-101-3p表達呈負相關。
二：為了確定PTAR對卵巢癌腫瘤發(fā)生和轉移的影響，作者構建裸鼠異種移植腫瘤模型。種植sh-PTAR OvCa細胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤淋巴結的大小和總數(shù)較對照組裸鼠高。同時，腫瘤結節(jié)數(shù)和腫瘤重量也顯著低于對照組。此外，免疫組化、Western blot、qRT-PCR 結果顯示PTAR敲減組中E-cadherin表達增加而FN1，ZEB1和vimentin 表達降低。即敲減PTAR能夠抑制卵巢癌腫瘤發(fā)生以及EMT現(xiàn)象。
三：接下來，作者向OvCa細胞中進行PTAR的過表達，劃痕實驗、侵襲實驗結果顯示PTAR的過表達能夠增強SKOV3和A2780細胞的細胞遷移與侵襲能力，而聯(lián)用miR-101處理后這些現(xiàn)象被阻斷。此外，過表達PTAR可以導致OVCAR3細胞中E-鈣粘蛋白的下調(diào)和ZEB1的上調(diào)，而當PTAR與miR-101 mimics共轉染時，EMT受到抑制。以上實驗表明PTAR的表達能夠促進EMT的發(fā)生，但在miR-101的過表達后其作用被逆轉。
四：TGF-β1可以誘導細胞遷移侵襲能力增加，上調(diào)間質化marker表達，但敲減PTAR后這些過程受到抑制，而當加入miR-101抑制劑后，這種抑制作用被解除。以上表明PTAR的沉默能夠減弱了TGF-β1誘導的卵巢癌細胞的發(fā)生，可能通過調(diào)節(jié)miR-101的表達參與這一過程。
五：接下來，作者驗證了PTAR是否通過充當ceRNA來調(diào)節(jié)miR-101的表達和活性。當運用10 ng/ml TGF-β1 處理SKOV3 、A2780 細胞48h后, PTAR 表達上調(diào)，而miR-101 表達下調(diào)。敲減PTAR后，miR-101 表達上調(diào)。于是作者構建PTAR的熒光素酶報告載體，包括 miR-101預測的結合位點的野生型或突變型質粒。結果發(fā)現(xiàn) PTAR-WT 與miR-101 共轉，熒光素活性降低50%。以上實驗證明PTAR通過充當ceRNA而抑制miR-101的表達和活性。
六：據(jù)報道，在肝細胞癌和卵巢癌中的，EMT現(xiàn)象能夠被 miR-101抑制。為了驗證抑制miR-101是否促進OvCa細胞中的EMT進程，作者在OvCa細胞沉默miR-101后發(fā)現(xiàn)， E-cadherin 表達下調(diào)，vimentin 和FN1表達上調(diào)。此外，劃痕以及侵襲實驗表明抑制 miR-101能夠促進SKOV3細胞和A2780細胞的遷移。進一步的研究表明，miR-101的過表達抑制了SKOV3細胞中ZEB1的mRNA以及蛋白質水平。以上實驗表明ZEB1是miR-101的直接靶標之一，并調(diào)控miR-101對OvCa細胞中EMT現(xiàn)象的發(fā)生以及細胞遷移的影響。
七：最后為了進一步驗證miR-101的功能，作者在SKOV3和A2780細胞中過表達 miR-101 ，結果發(fā)現(xiàn)miR-101能夠抑制OvCa細胞中細胞遷移、侵襲能力，抑制EMT現(xiàn)象的發(fā)生。
通過以上的實驗，作者證明PTAR可以作為miR-101的競爭性RNA（ceRNA）來抑制miR-101的表達，進而導致ZEB1表達上調(diào)，促進卵巢癌細胞中的EMT現(xiàn)象的發(fā)生，促進卵巢癌細胞的惡性化進程。
哎呀，故事好像還沒有講完，大師兄lncRNAs技高一籌，打敗了小師弟，救出了心愛的姑娘，過上了幸福的生活……
ceRNA的機制就介紹到這里啦，希望可以為大家進行非編碼RNA研究提供思路。
參考文獻：
Liang Haihai,Yu Tong,Han Yue et al. LncRNA PTAR promotes EMT and invasion-metastasis in serous ovarian cancer by competitively binding miR-101-3p to regulate ZEB1 expression.[J] .Mol. Cancer, 2018, 17(1): 119.
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