ChIP-seq是一種結(jié)合免疫共沉淀和二代測序來研究組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與DNA之間相互作用的技術(shù)。在這類研究中，很多因素都會影響研究結(jié)果，因此要做足功課才能獲得一個接近完美的研究結(jié)果。需要做哪些功課呢？小編帶著大家一起來看一下~
樣本準(zhǔn)備
ChIP實驗中不同的研究對象需要的樣本量是不同的。因組蛋白的表達(dá)量相對較高，如果研究組蛋白與DNA的相互作用，需準(zhǔn)備的細(xì)胞量為105-106；而轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量相對較少，需要的細(xì)胞量就相對較高，需準(zhǔn)備的細(xì)胞量為106-107。當(dāng)樣本是組織時，就需根據(jù)組織樣本能提出的染色質(zhì)量決定，與植物相比，一般動物組織需求量較少。
抗體選擇
ChIP實驗中需求的抗體至少是ChIP級，即我們在查詢抗體時需有“ChIP-Grade”標(biāo)識。一般常見的組蛋白H3K4me3、H3K9me3等都有對應(yīng)的ChIP級商業(yè)化抗體，常用的抗體牌子有abcam、merck millipore等。對于沒有ChIP級抗體的組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，可通過轉(zhuǎn)標(biāo)簽蛋白進(jìn)行，最經(jīng)常使用的標(biāo)簽包括HA、Flag、GFP、c-myc等。
我們可通過兩種方式驗證抗體是否可以跨物種使用：
通過WB實驗驗證抗體有無特異性。若特異性較強(qiáng)，該抗體就可以跨物種使用。
通過比對目的蛋白在兩個物種中序列的同源性。若同源性在80%以上，該抗體就可以跨物種使用。
小編給大家分享一個抗體查詢網(wǎng)址：https://www.citeab.com/browse/suppliers，可查詢目的蛋白有無相應(yīng)的抗體。
生物學(xué)重復(fù)
ChIP-seq是否要設(shè)置生物學(xué)重復(fù)一直是大家比較關(guān)心的問題。由于ChIP實驗操作難度較大、步驟繁瑣、影響因素多， 所以ChIP-seq中生物學(xué)重復(fù)的一致性相對較差，很多人都不建議設(shè)置生物學(xué)重復(fù)。但近幾年很多高分文章在進(jìn)行ChIP-seq研究時都設(shè)置了大量的生物學(xué)重復(fù)。鑒于這兩種情況，我們可以得出兩個結(jié)論：ChIP-seq可以不設(shè)置生物學(xué)重復(fù)；如果設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，要盡可能增加重復(fù)個數(shù)。
小編給大家分享一篇設(shè)置多個生物學(xué)重復(fù)的文章供大家參考：
Histone Acetylome-wide Association Study of Autism Spectrum Disorder. DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.Cell.2016.10.031
對照設(shè)置
做ChIP實驗時經(jīng)常要設(shè)置非特異抗體IgG為陰性對照，那么ChIP-seq需要用IgG富集的產(chǎn)物進(jìn)行背景噪音的去除嗎？No！一般不建議用IgG產(chǎn)物作為ChIP-seq的對照，原因如下：
大多數(shù)IgG抗體與轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白抗體不是來源于同一動物的免疫前血清。
IgG通常能富集到很少的DNA，導(dǎo)致后期建庫過程中PCR循環(huán)數(shù)增加，不能達(dá)到作為對照去除背景噪音的目的。
Input可以很好的避免上述問題，起到去除背景噪音的作用。此外通過IP與input比較可以驗證染色質(zhì)斷裂效果。小編今天要分享的內(nèi)容就這么多，都get了嗎？
