聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）
聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。
PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：
(1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；
(2) 由少量mRNA生成 cDNA文庫；
(3) 從cDNA中克隆某些基因；
(4) 生成大量DNA以進行序列測定；
(5) 突變的分析；
(6) 染色體步移；
(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。
一、試劑準備
1. DNA模版
2．對應(yīng)目的基因的特異引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶 （2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2． 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
3． 結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化
PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。
1． 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應(yīng)時，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3． Taq DNA聚合酶酶：在100μl反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應(yīng)體積時（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4． 引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：
⑴ 引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機的。
⑵ 引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機輔助設(shè)計。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。
⑸ 引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5． 模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。
6． PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間，可增加產(chǎn)物的特異性。
四、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。最好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
huangzhiqiang07 發(fā)表于 08-10-26 13:25
RNA酶活性的控制
RNA酶活性的控制
為了獲得高質(zhì)量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內(nèi)其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數(shù)有經(jīng)驗的研究者并不拘泥于這些注意事項，只是在遇到問題時可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。
實驗程序
RNA酶的抑制劑
破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法
（一）實驗程序
如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品：
（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于180 ℃干烤８小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次， 并于100℃干烤15分鐘（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。
羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。
（２）研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應(yīng)勤換手套。
（３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應(yīng)用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液?？纱鎺灼啃碌奈撮_封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。
（二）RNA酶的抑制劑
下面介紹３種廣泛應(yīng)用的特異性RNA酶抑制劑。
（１）RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結(jié)合（KI≈3x1010）形成非共價結(jié)合的等摩爾復(fù)合物，使RNA酶失活。此蛋白質(zhì)體內(nèi)可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結(jié)構(gòu)與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應(yīng)置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應(yīng)棄之不用，因為上述處理會使蛋白質(zhì)變性從而釋放出所結(jié)合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應(yīng)使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時應(yīng)使用這種抑制劑，并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應(yīng)有此蛋白質(zhì)存在。由于酚抽提可以除蛋白質(zhì)抑制劑，故應(yīng)在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。
（２）氧釩核糖核苷復(fù)合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是量種過渡態(tài)類似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復(fù)合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些外酶促反應(yīng)（如mRNA反轉(zhuǎn)錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復(fù)合物。
（３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發(fā)現(xiàn)它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續(xù)的RNA純化過程中（如酚抽提后）經(jīng)離心去除。
(三）破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法
用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)， 導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯(lián)用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。下述實驗程序系列利用RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關(guān)方法從組織或細胞培養(yǎng)物中分離總RNA、核內(nèi)RNA和胞質(zhì)內(nèi)RNA。
