供 稿：體外診斷學(xué)院 來 源：IVD銷售實(shí)戰(zhàn)課堂
新型冠狀病毒核酸檢測試劑研發(fā)—分子診斷技術(shù)應(yīng)用
總的來講，分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測DNA或RNA的結(jié)構(gòu)是否變化、量的多少及表達(dá)功能是否異常，以確定受檢者有無基因水平的異常變化，對疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。
按照技術(shù)原理，可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為PCR技術(shù)、分子雜交、基因測序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類。
分子診斷技術(shù)大家族
截止2020年3月，分子診斷產(chǎn)品獲批數(shù)量超1200項(xiàng)。從目前市場分子診斷產(chǎn)品來看，基于核酸診斷技術(shù)的產(chǎn)品仍占主要。從各類技術(shù)類別來看，PCR技術(shù)由于壁壘相對較低，國產(chǎn)化程度高，國內(nèi)企業(yè)布局相對較早，因此基于PCR技術(shù)的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。
從此次新型冠狀病毒肺炎產(chǎn)品注冊就可以看出，PCR技術(shù)發(fā)展已經(jīng)很成熟了。下面我們就來逐一解剖一下分子診斷技術(shù)這個(gè)大家庭！
基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR技術(shù)）
在1983年，美國人Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR),這一技術(shù)將DNA的變性原理以及復(fù)性原理加以利用，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復(fù)性，讓核酸片段實(shí)現(xiàn)了體外擴(kuò)增，可將極微量的目標(biāo)DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測，因?yàn)镻CR有著很高的靈敏度以及特異性，而且簡便快速，所以這種技術(shù)已經(jīng)成為目前臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接受程度最高的技術(shù)。同時(shí)，PCR技術(shù)又可以分為定量PCR和常規(guī)PCR，定量PCR分為實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和數(shù)字PCR。
PCR技術(shù)大致分類
但伴隨著PCR技術(shù)的迅猛發(fā)展,有關(guān)這項(xiàng)技術(shù)的質(zhì)量管理問題也日益突出,如何消除各類生物學(xué)變量所引起的檢測變異,減少或抑制實(shí)驗(yàn)操作與方法學(xué)中的各種干擾因素是PCR技術(shù)面臨的難題。比如此次新型冠狀病毒核酸檢測假陰性問題，就是技術(shù)面臨的一些現(xiàn)實(shí)問題。
基因測序技術(shù)
基因測序是直接獲得核酸序列信息的唯一技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項(xiàng)重要分支。雖然分子雜交、分子構(gòu)象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設(shè)上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術(shù)上的金標(biāo)準(zhǔn)。
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第1代測序
1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進(jìn)行DNA序列測定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學(xué)修飾降解法的模型,為核酸測序時(shí)代的來臨拉開了序幕。經(jīng)典的Sanger測序技術(shù)，被稱作是測序界的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著高通量測序技術(shù)應(yīng)用拓展，基因測序技術(shù)將不斷升級，也將進(jìn)一步提高占比，成為未來腫瘤檢測的主要技術(shù)。目前測序市場主流為NGS測序平臺。
第二代測序
NGS高通量測序技術(shù)又稱第二代的測序技術(shù)，就是對幾百萬到數(shù)十億的DNA分子一次性實(shí)現(xiàn)并行測序。可對一個(gè)物種的全部轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致地分析。在基因組水平上對未知序列的物種進(jìn)行從頭測序，獲得該物種的基因序列，為后續(xù)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)；進(jìn)行參考序列物種的全基因組測序，并在全基因組這一水平之上進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子變化。
第三代測序
第三代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測序，單分子測序平臺給測序技術(shù)帶來新思路，部分已經(jīng)開始商業(yè)化推廣，但尚未達(dá)到NGS的規(guī)模。
相比二代測序，第三代測序技術(shù)在臨床上的應(yīng)用有明顯優(yōu)勢：第三代測序技術(shù)不需要PCR擴(kuò)增，可直接對單個(gè)分子進(jìn)行測序;樣品制備簡單，測序成本進(jìn)一步降低；可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內(nèi)的DNA修飾。這些優(yōu)勢可以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質(zhì)量，但單分子測序有通量限制，所以并不適合獨(dú)立做全基因組測序，更適于針對有限的、個(gè)性化的、目標(biāo)性的應(yīng)用。
分子雜交技術(shù)
分子雜交就是指兩條有著同源序列的核酸單鏈，通過堿基互補(bǔ)配對這一原則相結(jié)合，進(jìn)而形成雙鏈的這一過程，它能夠通過已知序列的基因探針對目標(biāo)序列加以捕獲和檢測。
進(jìn)行雜交的雙方分別是探針以及有待探測的核酸，有待檢測的對象可以選擇基因組的DNA,也可以選擇細(xì)胞總DNA,可以對其進(jìn)行提純，也可以對其進(jìn)行細(xì)胞之內(nèi)的雜交，也就是細(xì)胞原位雜交。必須對探針進(jìn)行標(biāo)記，這樣才可以進(jìn)行示蹤以及檢測。
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同位素是最為普遍應(yīng)用的探針標(biāo)記物，多使用類化合物地高辛配基（digoxigenin,DIG)標(biāo)記。核酸分子雜交因具有高靈敏度和高特異性，在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測等方面因?yàn)楹怂岱肿与s交的靈敏度以及特異性都很高，因此這一技術(shù)已經(jīng)在克隆基因篩選以及基因組之中待測的基因序列定性、定量檢測之中得到了廣泛的應(yīng)用。
核酸質(zhì)譜技術(shù)
目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。簡單來講，兩種電離技術(shù)都是軟電離，ESI 檢測的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷，質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區(qū)間，從而能檢測幾萬乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到單電荷峰，與飛行時(shí)間(TOF)分析器搭配，檢測范圍可以到幾十萬道爾頓。
質(zhì)譜技術(shù)相比于其他檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，近年來在核酸的高級結(jié)構(gòu)鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
由于生物樣品的復(fù)雜性，質(zhì)譜技術(shù)還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具，隨著臨床實(shí)驗(yàn)室對質(zhì)譜的了解和應(yīng)用不斷的加深，未來該檢測平臺或可成為規(guī)范實(shí)驗(yàn)室不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)裝備。
生物芯片技術(shù)
生物芯片技術(shù)在最近的一些年里才得到了發(fā)展，這種分析與檢測的技術(shù)將分子生物學(xué)以及微電子技術(shù)之間進(jìn)行有效結(jié)合。因此，這種技術(shù)又被稱作基因芯片技術(shù)或者是DNA芯片技術(shù)。在當(dāng)今，這一技術(shù)在免疫反應(yīng)以及受體結(jié)合等的這些非核酸領(lǐng)域之中得到了廣泛的擴(kuò)展，出現(xiàn)了組織芯片、細(xì)胞芯片、免疫芯片以及蛋白質(zhì)芯片等，所以又將官這種技術(shù)改稱作生物芯片技術(shù)。
生物芯片技術(shù)是通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成密集排列的分子微陣列，以實(shí)現(xiàn)對核酸、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、組織以及其他生物分子進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的檢測。生物芯片技術(shù)的本質(zhì)特征是將生命科學(xué)研究中的樣品制備、生化反應(yīng)以及檢測分析等過程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化及微型化。
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微陣列芯片
也就是常說的基因芯片，又稱DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片，是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片(如玻片、膜)上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，通過檢測雜交信號，對生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。
與傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的分辨率，可識別Kb級別以上的染色體細(xì)微失衡。基因芯片目前已成為國內(nèi)外臨床遺傳學(xué)診斷的一項(xiàng)常規(guī)的技術(shù)，在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測、個(gè)性化用藥等方面均呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購)、安捷倫等。
微流控芯片
微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級流體的管道、反應(yīng)器等元件構(gòu)成，與宏觀尺寸的分析裝置相比，其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比，以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)和擴(kuò)散效應(yīng)在內(nèi)的特殊性能，從而在一張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預(yù)處理、分子生物學(xué)反應(yīng)、檢測等系列實(shí)驗(yàn)過程。目前使用微流控芯片進(jìn)行指導(dǎo)用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測是主要臨床應(yīng)用領(lǐng)域。
總結(jié)：分子診斷市場未來可期！
分子診斷技術(shù)的應(yīng)用不僅深化對疾病發(fā)病機(jī)制分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，而且不斷擴(kuò)大了分子診斷疾病的病種，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，并通過這些基本技術(shù)的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和信息。
