背景
隨著2017年底MSK和FMI的兩個(gè)大panel分別獲得FDA批準(zhǔn)；2018年國(guó)外——百時(shí)美施貴寶的歐狄沃（CFDA：非小細(xì)胞肺癌）、的科瑞達(dá)（CFDA：黑色素瘤和ALK陰性的非鱗狀非小細(xì)胞肺癌）國(guó)內(nèi)——君實(shí)的特瑞普利單抗(CFDA:黑色素瘤)、信達(dá)的信迪利單抗（CFDA:霍奇金淋巴瘤）以及恒瑞5月份剛獲批的卡瑞麗珠單抗（CFDA：霍奇金淋巴瘤）先后上市（圖1A,圖1B）。 同時(shí)鑒于PD-1/PD-L1抗體只對(duì)每一種癌癥的一部分病人有效果（例如在肺癌中僅對(duì)大約30%的肺癌患者起效）。腫瘤突變負(fù)荷（TMB）作為PD-L1表達(dá)、MSI/dMMR 等之外的PD-1/PD-L1藥物療效的標(biāo)志物之一必然會(huì)受到進(jìn)一步的重視。
目前不少基因檢測(cè)公司直接將MSK和FMI兩家產(chǎn)品的基因取并集后再做簡(jiǎn)單的增添，推出500多個(gè)基因的大panel產(chǎn)品用來(lái)檢測(cè)TMB。但同時(shí)市面上一些先行者則在已有的400-500個(gè)gene的panel產(chǎn)品上直接升級(jí)到800-1100個(gè)基因的panel。最后市面上各家公司的大panel都宣稱適用于泛實(shí)體瘤的TMB評(píng)估，這個(gè)“泛實(shí)體瘤”的癌種范圍到底有多“泛”也值得推敲。接下來(lái)在該轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)專題中分兩篇文章嘗試對(duì)TMB與panel設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，本篇著重回答以下3個(gè)TMB相關(guān)問(wèn)題，下一篇著重分析panel設(shè)計(jì)：
Question1: 不同數(shù)量級(jí)別的panel在不同癌種上的TMB與WES金標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性差異以及指定TMB區(qū)間內(nèi)不同panel的TMB波動(dòng)情況又是怎么樣？
Question2: 大panel是否在各個(gè)癌種上與WES數(shù)據(jù)TMB相關(guān)性都比小的panel高？
Question3: 市面上從WES 的2,1000多個(gè)gene中抽取 1/40~1/20做出來(lái)的500-1000 gene 的各種panel，其TMB在“泛”癌種上都能代替WES測(cè)序？
a. 數(shù)據(jù)來(lái)源：2018年TCGA數(shù)據(jù)挖掘文獻(xiàn)和2015年腫瘤純度分析綜述文獻(xiàn);
b. TMB計(jì)算方法： CCDS區(qū)域的突變頻率在5%以上的插入/缺失、錯(cuò)義和無(wú)義突變（本次不采用FMI的去除熱點(diǎn)突變同時(shí)引入同義突變的TMB計(jì)算方法）；
c. 模擬panel基因數(shù)目梯度設(shè)計(jì)：S1: ~580 genes(MSK+FMI+其它),S2: ~670 genes (580+90);S3: 707genes (580+127); S4:~800 genes (580+90+127)；S5： WES: 21,000 genes；
d. 外顯子區(qū)域： WES:下載current.CCDS.txt，提取exon區(qū)間后liftover轉(zhuǎn)換為hg19版本, panel：以gene為的單位提?。▏?yán)格來(lái)講應(yīng)根據(jù)染色體位置來(lái)匹配，本次偷懶，暫時(shí)不考慮約3%的一基因多名稱的干擾）。
一. 不同大小梯度的panel TMB與WES TMB在各癌種上的相關(guān)性分析
1.1 TMB數(shù)據(jù)分布特征分析
指定癌種病人TMB理論上整體偏低，數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布特征，Q-Q圖和Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)也支持以上推斷，因此后續(xù)相關(guān)分析結(jié)果以spearman為準(zhǔn)，同時(shí)列出pearson相關(guān)系數(shù)以作比較。
1.2 四個(gè)不同梯度 panel TMB與WES TMB 在32個(gè)癌種上的相關(guān)性分析
固定TMB計(jì)算方法和輸入數(shù)據(jù)，實(shí)際變量為panel大小，分析不同大小panel在不同癌種上的TMB與WES的相關(guān)性。
在葡萄膜黑色素瘤（UVM）、胰腺癌(PAAD)、直腸腺癌(READ)等癌種上pearson相關(guān)系數(shù)比spearman相關(guān)系數(shù)高了不止一點(diǎn)點(diǎn)，由于pearson相關(guān)對(duì)異常值敏感，猜測(cè)本次分析的這些癌種TMB存在異常值。分析原始數(shù)據(jù)，不管是用x±3S，還是其它方法，確實(shí)存在TMB異常高的個(gè)體，參考異常值處理中的四分位距替換法，以上三個(gè)癌種處理異常值后的pearson相關(guān)系數(shù)大幅下降，而對(duì)spearman相關(guān)影響不大。推測(cè)其它癌種效果相似，總之實(shí)際問(wèn)題中如果想省去數(shù)據(jù)分布特征及異常值情況評(píng)估這一步，應(yīng)直接使用spearman相關(guān)。
50%的癌種（16/32）上panel TMB與WES TMB的spearman相關(guān)性低于0.65，只是在常見(jiàn)的肺鱗癌、肺腺癌、皮膚黑色素瘤、結(jié)腸癌等癌種上有較好的spearman相關(guān)性（注意彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤本次只有33個(gè)數(shù)據(jù)），市面上各種 panel的TMB可能只適用于部分實(shí)體瘤相關(guān)的免疫治療評(píng)估；
臨床入組前準(zhǔn)確的腫瘤診斷分型很重要--例如：葡萄膜黑色素瘤與皮膚黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌與子宮肉瘤、結(jié)腸癌與直腸腺癌等，spearman相關(guān)系數(shù)相差很大（#準(zhǔn)確翻譯TCGA上的癌種英文名稱也很重要，第一版的翻譯就不準(zhǔn)，后續(xù)圖中的癌種中文名以上面表格中的名稱為準(zhǔn)）；
從近600個(gè)基因增加到近800個(gè)基因后，大部分癌種上panel TMB與WES TMB的spearman相關(guān)性是有一定提升的（如上圖4），如腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）上相關(guān)性提升了接近10%；但是在一些癌種如彌漫性大B淋巴瘤（DLBC）上，相關(guān)性反而降低5%左右（如下圖5）。所以本次模擬增加的基因只是提高了彌漫性大B淋巴瘤和胸腺癌以外其它30個(gè)癌種 TMB與WES相關(guān)性。
798 panel 和 579 panel在32個(gè)癌種上TMB相關(guān)系數(shù)近似正態(tài)分布；bartlett.test 方差齊性檢驗(yàn) p-value = 0.7411，顯示兩組數(shù)據(jù)離散程度相當(dāng)，直接采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)做進(jìn)一步分析：WES和panel TMB spearman相關(guān)性均值之差為0.027，!=0，95%置信區(qū)間為：（0.017，0.038），p-value = 1.157e-05。將panel從600個(gè)gene級(jí)別增加到800個(gè)級(jí)別從32個(gè)癌種整體上看確實(shí)可以提高其TMB與WES的相關(guān)性。
二. 不同梯度panel 在給定10個(gè)區(qū)間上與WES TMB的比較
雖然2019年第一版的非小細(xì)胞肺癌NCCN指南中指出如何衡量TMB閾值目前還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)（圖8A），但借鑒CheckMate-227研究中Opdivo（nivolumab）+ Yervoy（ipilimumab）聯(lián)合療法一線療法，對(duì)于高TMB（TMB≥10個(gè)/Mb，無(wú)論P(yáng)D-L1表達(dá)如何）的晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）達(dá)到了無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）的結(jié)果(圖8B)，本次的TMB區(qū)間應(yīng)在10左右上下浮動(dòng)。
以給定TMB區(qū)間的WES樣本為準(zhǔn)，與落入該區(qū)間的樣本在各個(gè)模擬panel的TMB進(jìn)行比較，分析不同大小panel在同一批病人上檢出TMB的穩(wěn)定性：
隨著基因數(shù)目的增加，與WES 數(shù)據(jù)的TMB相比， panel TMB值分布的四分位圖中的離群點(diǎn)、上邊緣、下邊緣等指標(biāo)在指定10個(gè)區(qū)間中的5個(gè)區(qū)間有較為明顯的好轉(zhuǎn)：5.5-6.49，6.5-7.49，8.5-9.49，9.5-10.49，10.5-11.49（也可以對(duì)10個(gè)TMB區(qū)間的四分位距做個(gè)Wilcoxon test，但本次劃分區(qū)間少，同時(shí)也反映不出來(lái)異常值信息，暫不做定量判斷）；
常規(guī)TMB計(jì)算方法得到的TMB，panel都要比WES高一截，這其實(shí)正常--panel畢竟都是從2,1000多個(gè)基因中挑選腫瘤相關(guān)基因設(shè)計(jì)的，本身就帶有偏好性，如果接近程度很好就有些奇怪了--用bootstrap的方法從基因全集里面迭代出部分子集應(yīng)該可以做出好看的結(jié)果。
三. 小結(jié)
a. 不同癌種,影響其TMB的基因集合差異也較大，設(shè)計(jì)大panel前可以充分利用TCGA相關(guān)的開(kāi)源數(shù)據(jù)，反復(fù)調(diào)試迭代，找到既能均衡部分癌種 panel TMB與WES TMB的相關(guān)性，又可以使得該 panel TMB在各個(gè)指定區(qū)間內(nèi)波動(dòng)較小的基因集合，簡(jiǎn)單的將FDA已公布的MSK和FMI的基因取交集是不夠的；
b. panel包含的gene越多，其TMB與WES的相關(guān)性越高、穩(wěn)定性越好的結(jié)論實(shí)際上是因癌種而異的，例如本次模擬的798panel,其TMB與WES的相關(guān)性在彌漫性大B淋巴瘤上的表現(xiàn)反而大幅下降（**注意本次僅使用33個(gè)DLBC樣本，而信迪利單抗和卡瑞麗珠單抗相關(guān)的霍奇金淋巴瘤的WES數(shù)據(jù)本次未引入）；
c. 800個(gè)gene規(guī)模的panel得到的TMB確實(shí)會(huì)比500-600個(gè)基因的panel 穩(wěn)定一些；
d.不同的癌種存在不同的TMB cutoff值（如下圖8）, 其具體數(shù)值必然受該panel設(shè)計(jì)的gene影響，大而全的panel在計(jì)算TMB時(shí)似乎可通過(guò)取子集的方式保證足夠的冗余度（僅限于部分癌種） ;
e. 如果不談銷售渠道提成，直接上500X的WES可能也是個(gè)行的通的辦法：一方面PD-1/PD-L1藥物的適應(yīng)癥一直在拓展，另一方面與panel相比，畢竟WES測(cè)序成本沒(méi)高多少，而且在近一半的癌種上panel TMB其實(shí)并沒(méi)有較好的反映WES金標(biāo)準(zhǔn) 。
寫于2019年4月8日
