澳門科技大學(xué) | Gut：人參多糖改變腸道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增強anti-PD-1 / P...
編譯：微科盟萌依依 ，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。
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導(dǎo)讀背景：程序性死亡1及其配體1（PD-1 / PD-L1）免疫療法有望用于晚期肺癌治療，但應(yīng)答率有待提高。腸道菌群在免疫療法致敏中起關(guān)鍵作用，人參已顯示具有免疫調(diào)節(jié)潛力。在這項研究中，作者旨在研究人參多糖（GPs）和αPD-1單克隆抗體（mAb）的聯(lián)合治療是否可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來敏化應(yīng)答。實驗方法：作者給同基因小鼠模型施用GPs和αPD-1mAb，通過糞便微生物菌群移植（FMT）和16S PacBio單分子實時（SMRT）測序評估聯(lián)合治療對腸道菌群的抗腫瘤敏化作用。為了評估免疫相關(guān)的代謝產(chǎn)物，對血漿樣品進行了代謝組學(xué)分析。結(jié)果：作者發(fā)現(xiàn)GPs通過增加微生物代謝產(chǎn)物戊酸和降低L-犬尿氨酸以及Kyn / Trp的比例來增加對αPD-1mAb的抗腫瘤反應(yīng)，這有助于抑制調(diào)節(jié)性T細胞并在誘導(dǎo)后Teff細胞誘導(dǎo)聯(lián)合治療。此外，微生物分析表明，在臨床上對PD-1阻滯劑的響應(yīng)者中，Parabacteroides distasonis和Bacteroides vulgatus的含量高于未響應(yīng)者。此外，組合療法通過將腸道菌群從無反應(yīng)者重塑成有反應(yīng)者而使從六只無反應(yīng)者接受FMT的小鼠對PD-1抑制劑的反應(yīng)敏感。結(jié)論作者的結(jié)果表明，GPs聯(lián)合αPD-1mAb可能是使非小細胞肺癌患者對PD-1免疫治療敏感的一種新策略。腸道菌群可以用作預(yù)測抗PD-1免疫療法反應(yīng)的新型生物標志物。原名：Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand1 (anti-PD- 1/PD-L1) immunotherapy
譯名：人參多糖改變腸道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增強抗程序性細胞死亡1 /程序性細胞死亡配體1（anti-PD-1 / PD-L1）免疫療法的抗腫瘤作用
期刊：Gut
IF：23.059
發(fā)表時間：2021.5
通訊作者：Elaine Lai-Han Leung & 魏泓 & Yabing Cao
通訊作者單位：澳門科技大學(xué) & 中山大學(xué) & 澳門鏡湖醫(yī)院
1. 聯(lián)合療法可增強αPD-1mAb在荷瘤小鼠模型中的抗腫瘤作用為了研究GP是否可以增強αPD-1mAb的抗腫瘤作用，作者首先評估了接種了LLC（路易斯肺癌細胞）的C57 BL/6J小鼠的腫瘤生長過程。分別在腫瘤接種后第0天和第9天開始對小鼠進行GP灌胃和αPD-1mAb注射（圖1A）。最初通過腫瘤體積和腫瘤重量評估其抗腫瘤作用（圖1B，C）。聯(lián)合治療后，傳統(tǒng)的帶有LLC的小鼠表現(xiàn)出對αPD-1mAb的增強反應(yīng)并降低了腫瘤進展（在線補充圖1A）。在第24天，與單獨的媒介物治療組和αPD-1mAb治療組相比，聯(lián)合治療組分別表現(xiàn)出75.2％和65.1％的腫瘤生長抑制。相應(yīng)地，小鼠的存活期顯著延長（圖1D）。這些結(jié)果表明，聯(lián)合治療可改善帶有LLC的小鼠中αPD-1mAb的抗腫瘤作用。作者還在具有LLC細胞的HuPD-1小鼠（圖1E，F(xiàn)）和B16-F10荷瘤的小鼠（在線補充圖1B，C）中觀察到了這種增強的抗腫瘤作用。圖1 GPs在傳統(tǒng)和人源化PD-1敲入（HuPD-1）LLC小鼠中增強了αPD-1mAb的抗腫瘤作用。（A）經(jīng)GP αPD-1mAb聯(lián)合治療LLC小鼠的示意圖。（B）每組的腫瘤生長曲線。常規(guī)C57 BL/6J小鼠在腫瘤接種后第0天接受GP注射，并在第9天腹膜內(nèi)注射αPD-1mAb。（C）常規(guī)LLC荷瘤小鼠的腫瘤重量。（D）常規(guī)LLC小鼠的生存曲線。（E）在攜帶huPD-1敲入LLC的每組小鼠模型中的腫瘤生長曲線。（F）HuPD-1敲入的荷瘤小鼠的腫瘤重量。數(shù)據(jù)代表一個或三個獨立實驗，每組n = 5-10。誤差棒代表平均值±SEM。通過具有Sidak校正的雙向ANOVA評估腫瘤生長曲線。通過單向方差分析評估腫瘤重量。對生存數(shù)據(jù)進行對數(shù)秩（Mantel-Cox）測試。 * p＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。 GP，人參多糖； LLC，Lewis肺癌； mAb，單克隆抗體； PD-1，程序性死亡1。
2. 聯(lián)合治療的體內(nèi)抗腫瘤作用與提高的免疫力有關(guān)為了確定聯(lián)合療法對免疫系統(tǒng)的影響，作者使用流式細胞儀分析了外周血，脾臟和腫瘤組織的免疫學(xué)變化。作者觀察到，與單獨的αPD-1mAb組相比，聯(lián)合組的CD8 / CD4 比在外周（血液和脾臟組織）和腫瘤組織中均增加（圖2A）。在外周和腫瘤組織中，CD8 T細胞中功能性細胞因子，IFN-γ，TNF-α和GZMB的產(chǎn)生也均增加（圖2B–D，（在線補充圖2），表明了該藥物組合的有益作用。圖2 組合療法治療后，細胞毒性CD8 T細胞數(shù)量增加，而Treg細胞數(shù)量減少。在帶有LLC的小鼠中，接種腫瘤24天后，小鼠用αPD-1mAb，GP或GP和αPD-1mAb聯(lián)合治療。分析血液，脾臟和腫瘤中的免疫細胞。（A-E）CD8 / CD4 T細胞比率，血液，脾臟和腫瘤組織中CD8 T細胞和FOXP3 CD4 T細胞中IFN-γ，TNF-α，顆粒酶B（GZMB）的表達。（F）放大400倍時腫瘤組織中CD4，CD8，IFN-γ，TNF-α和GZMB的代表性IHC譜圖。比例尺= 50μm。（G–K）使用帶有ImmunoRatio插件的image J軟件（NIH）對每個視場的正區(qū)域進行定量分析。數(shù)據(jù)表示為15個字段的平均值，并表示為平均值±標準差（n = 6）。將所有實驗重復(fù)兩次或三次。每個符號代表一只動物。數(shù)據(jù)代表平均值±SD，并通過單向方差分析進行分析。 * p ＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。GP，人參多糖；IFN-γ，干擾素-γ；IHC，免疫組化；LLC，Lewis肺癌； mAb，單克隆抗體；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；Treg，調(diào)節(jié)性T細胞。作者還觀察到外周和腫瘤組織中FoxP3 調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞的下調(diào)（圖2E），而IHC譜在腫瘤組織中得到了一致的結(jié)果（圖2F–K），這些結(jié)果表明聯(lián)合治療可能通過激活CD8 T細胞并抑制Tregs的功能。調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）是免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的主要參與者，通常與不良的預(yù)后和生存率相關(guān)。臨床研究已經(jīng)確定了一組患者，這些患者可能因抗PD-1治療而導(dǎo)致癌癥的HPD（高度進展性疾?。╋L(fēng)險增加。在作者的研究中，GP與αPD-1mAb聯(lián)合使用可減少外周和腫瘤中FoxP3 Treg的比例，這可能有助于預(yù)防HPD?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)表明聯(lián)合治療具有增強的抗腫瘤免疫作用。3. 聯(lián)合治療可防止腸道菌群失調(diào)為了研究口服GPs是否會改變腸道菌群，作者對所有治療組的糞便樣本進行了16S PicBio SMRT測序。與單獨使用αPD-1mAb的組相比，聯(lián)合治療后，微生物組成發(fā)生了變化，Muribaculum的豐度顯著增加（圖3A，B）。當(dāng)與GP和空白對照組進行比較時，作者還觀察到了Muribaculaceae的增加（在線補充圖3），這表明GP可能具有豐富Muribaculaceae豐度的潛力。為了進一步闡明腸道菌群與抗腫瘤作用之間的因果關(guān)系，作者評估了用抗生素治療的帶有LLC的小鼠的腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)抗生素治療損害了抗腫瘤功效（圖3C，D）。在維持腸道免疫力方面，對結(jié)腸的組織病理學(xué)評估表明，聯(lián)合治療可減少結(jié)腸中炎性細胞的浸潤（圖3E，F(xiàn)）。IEL在維持屏障功能和降低對感染和免疫病理的敏感性中起著至關(guān)重要的作用。為了研究聯(lián)合治療是否會影響IEL，作者采用了RNA測序技術(shù)來檢查小腸中IEL的轉(zhuǎn)錄組變化。與單獨使用αPD-1mAb的組相比，上皮內(nèi)保護基因（CLCA3，Zg16，Pla2g10，Agr2，Guca2a和Tff3），28-30個與代謝相關(guān)的基因（Dgat2和Ces2a）和S100A6在聯(lián)合治療組的表達顯著上調(diào)。相反，免疫球蛋白可變區(qū)重鏈基因（Ighv1-64，Ighv6-6，Ighv5-4，Ighv1-55，Ighv1-50和Ighv1-26），免疫球蛋白可變區(qū)輕鏈基因（Iglv2），免疫球蛋白κ可變表達在用聯(lián)合療法治療的小鼠的IEL中，基因（Igkv4-68），Lrrk2，Camsap2，Myo5a，Bmf，Slc29a3和Mios被下調(diào)（圖3G）。基因本體論（GO）分析表明，這些差異表達的基因主要與溶酶體，分泌顆粒和能量代謝有關(guān)，可以保護腸屏障的完整性（圖3H）。與單純使用GP組比較時，作者觀察到了聯(lián)合組的免疫應(yīng)答相關(guān)的基因被上調(diào)（圖3I，J）。
除了 SCFA，我們還測量了 52 種氨基酸和脂肪酸代謝物的變化（在線補充圖 4A）。我們觀察到，與PD-1 mAb 單獨治療組相比，聯(lián)合治療組中 L-犬尿氨酸和 Kyn/Trp 比值（表示為 IDO 活性）顯著降低，色氨酸代謝在這些代謝物中的貢獻最大，但 L-色氨酸沒有（在線補充文件4A–D，圖4H-J)。結(jié)果表明聯(lián)合治療可能與 IDO 活性有關(guān)。為了進一步研究腫瘤組織中的 IDO 活性，我們進行了 IHC 染色，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組中 IDO 的表達下調(diào)（圖4K）。為了確定GPs對腸道微生物中色氨酸代謝的影響，我們通過體外分批發(fā)酵系統(tǒng)對GPs進行人糞便樣品的元發(fā)酵。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在好氧和厭氧發(fā)酵條件下，GPs 顯著增加 L-色氨酸的產(chǎn)量并降低 L-犬尿氨酸的產(chǎn)量和犬尿氨酸/色氨酸的比例（在線補充表 1），表明 GPs 可以影響通過腸道微生物進行色氨酸代謝。
圖5 通過16S PacBio SMRT測序?qū)?yīng)答者（Rs）和非應(yīng)答者（NRs）之間腸道菌群多樣性的比較。（A）Rs（n = 10）和NRs （n = 6）組中的Shannon指數(shù)。（B）在物種級別上相對于每個組，排名前10位的相對豐度直方圖。（C）LEfSe分析用于在使用派姆單抗治療之前在Rs和NRs之間檢測到的差異豐富的分類單元。對于Mann-Whitney檢驗，閾值參數(shù)設(shè)置為p = 0.05，對于所有類別，多類分析選擇all against all。線性判別分析（LDA）得分> 2.0。（D-G）Rs和NRs之間的差異細菌。數(shù)據(jù)表示平均值±SD，并通過Mann-Whitney U檢驗進行分析。5 Pembrolizumab治療的NSCLC應(yīng)答者和非應(yīng)答者中腸道菌群組成存在明顯的區(qū)別納入了16名中國NSCLC患者，并接受了抗PD-1阻斷劑治療。其中十名患者被澳門江湖醫(yī)院的醫(yī)師評估為有反應(yīng)者（Rs），六名為無反應(yīng)者（NRs）。這些患者的臨床病理特征列在在線補充表2中。所有患者均接受了30個月以上的隨訪，并通過CT掃描監(jiān)測其反應(yīng)狀態(tài)（在線補充圖5A–C）。為了研究腸道微生物組的組成是否與抗PD-1免疫療法有關(guān)，收集了糞便基線樣本，并對其進行了16S PacBio SMRT測序。腸道微生物組的α多樣性表明Rs的豐富度和均勻度高于NRs（圖5A）。在物種水平上，作者觀察到Bacteroides vulgatus的相對豐度在Rs中居首位，并且三種腸道微生物的含量也過高：parabacteroidesdistasonis（p = 0.04），bacterium LF-3（p = 0.02）和Sutterella wadsworthensis HGA0223（p = 0.09；圖5B–G，（在線補充文件5D–G）。有趣的是，對于那些具有更好響應(yīng)和生存率的患者，這些細菌的豐度有所增加。6 GP恢復(fù)了非Rs糞便移植的LLC荷瘤小鼠中對αPD-1mAb治療的反應(yīng)在作者的初始研究中，作者發(fā)現(xiàn)GP增強了LLC荷瘤小鼠中αPD-1mAb的抗腫瘤作用。 GP是否可以逆轉(zhuǎn)人類對αPD-1mAb治療的反應(yīng)尚不清楚；因此，作者設(shè)計了一個FMT實驗來對其進行研究。將來自六個NRs的糞便微生物群轉(zhuǎn)移到GF小鼠中。定居后，將LLC腫瘤細胞接種到小鼠中。然后，使用之前的小鼠操作方案治療小鼠（圖6A）。正如預(yù)期的那樣，類似于NsR，作者發(fā)現(xiàn)小鼠對αPD-1mAb治療具有抗性。有趣的是，當(dāng)小鼠用GP加αPD-1mAb進行治療時，反應(yīng)得以恢復(fù)。聯(lián)合治療顯著延遲了腫瘤的生長（圖6B）。流式細胞儀分析和IHC分析表明，血液和腫瘤中CD8 T細胞的CD8 / CD4 T細胞比例以及IFN-γ，TNF-α和GZMB的產(chǎn)生均增加（圖6C–F，H–M ）。作者還觀察到聯(lián)合治療組中的Treg細胞更少，這與治療功效的改善相關(guān)（圖6G）。同時，作者測定了小鼠血漿中色氨酸和犬尿氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理后Kyn / Trp比值降低（圖6J）。一致地，作者還觀察到聯(lián)合治療后腫瘤組織中IDO的表達較低（圖6K，L）。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明GP可以使LLC小鼠中對αPD-1mAb的反應(yīng)敏感。
微生物代謝產(chǎn)物介導(dǎo)了微生物群與免疫細胞之間的交流。 SCFA是由于微生物降解多糖而產(chǎn)生的。用αPD-1mAb治療后，SCFA是否會影響宿主生理仍不清楚。Nomura等人觀察到在接受nivolumab（納武單抗）治療的實體癌患者中，糞便SCFA的豐度高于NRs。這些結(jié)果表明，增加的SCFA指向更長的無進展生存時間。在這項研究中，作者還觀察到，用αPD-1mAb治療后，所有的SCFA（包括丙酸，丁酸，異丁酸，戊酸，異戊酸和己酸）都會增加。特別是，血漿中通常很低的戊酸酯在與GPs和αPD-1mAb聯(lián)合處理后比單獨使用αPD-1mAb顯著增加。但是，相對較少的研究集中于戊酸。作者認為，戊酸可能作為HDAC抑制劑來延遲腫瘤進程和上調(diào)免疫應(yīng)答。因此需要開展進一步的研究探討戊酸是否對αPD-1mAb應(yīng)答具有潛在的治療作用，以及微生物群是否與該作用有關(guān)。有人提出IDO活性可能是抗PD-1治療的一種可能的機制，并且已將幾種聯(lián)合療法用于臨床試驗。盡管IDO-1抑制劑依帕多司他（ECHO-301 / KEYNOTE- 252試驗）與pembrolizumab聯(lián)合使用，但是由于許多原因在黑色素瘤患者中，IDO-1仍然是一種有前途的免疫檢查點，與Treg細胞活化的減弱有關(guān)。Kyn / Trp的比率越高，誘導(dǎo)的TGF細胞活化就越強。 Treg的產(chǎn)生和Teff細胞的產(chǎn)生的抑制以及不良的存活率。先前的一項研究表明人參皂苷可以降低小鼠血漿中犬尿氨酸的濃度和Kyn / Trp比值，但是GP是否顯示出類似的作用尚不清楚。作者在體外用GP發(fā)酵了來自健康供體的人類糞便樣品，發(fā)現(xiàn)在有氧和厭氧條件下色氨酸均增加，犬尿氨酸水平降低。此外，與單獨使用αPD-1mAb進行治療相比，聯(lián)合治療可通過減少鼠尿氨酸而不降低色氨酸來降低Kyn / Trp比值。該結(jié)果與增強的αPD-1mAb反應(yīng)和延長的生存時間一致。另外，響應(yīng)于犬尿氨酸的減少，外周Treg群體減少。作者還觀察到從NRs轉(zhuǎn)移微生物群的GF小鼠中IDO活性降低。總體而言，GP可能會通過降低IDO活性來改善對PD-1抑制劑的反應(yīng)。
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