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上周更新的文獻(xiàn)精讀秋季班第六講由饅頭老師主講外泌體研究套路。選取文獻(xiàn)來(lái)自于外周血管病1區(qū)雜志Circulation Research，2016年影響因子為13.965。

文獻(xiàn)中文題目：CD34+干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)血管生成機(jī)制促進(jìn)下肢缺血的修復(fù)作用。

通過(guò)題目可知，本研究的主題是干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，外泌體通過(guò)血管生成機(jī)制造成下肢缺血。之所以選擇外泌體這一主題，主要有兩個(gè)原因：（1）外泌體是一個(gè)研究熱點(diǎn)，在今年國(guó)自然中標(biāo)項(xiàng)目中，與外泌體相關(guān)的項(xiàng)目已達(dá)300多項(xiàng)。（2）外泌體應(yīng)用相對(duì)較為廣泛，在治療和診斷中都有很多文章報(bào)道。

首先介紹一下文章背景，干細(xì)胞對(duì)于組織的修復(fù)與再生主要是兩方面，第一方面干細(xì)胞直接分化為血管細(xì)胞，心肌細(xì)胞等，另外一方面是旁分泌作用，可以促進(jìn)血管新生，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，也可以促進(jìn)心肌細(xì)胞再生。最后，它還具有免疫調(diào)節(jié)作用。

10年之前，干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)集中在干細(xì)胞分化方向。在受損組織直接移植干細(xì)胞，并促分化新生細(xì)胞是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，直接的移植常常帶來(lái)不可預(yù)計(jì)的負(fù)面的效應(yīng)。

而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞旁分泌物-外泌體是干細(xì)胞介導(dǎo)干細(xì)胞受損修復(fù)作用的主要原因。因此干細(xì)胞來(lái)源的外泌體漸漸成為干細(xì)胞組織再生和修復(fù)作用領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。既然說(shuō)到了外泌體，下邊我們來(lái)介紹一下外泌體。

作者早在2011年已經(jīng)報(bào)道了CD34+干細(xì)胞來(lái)源外泌體與血管新生間的關(guān)系，我們先看一下這篇報(bào)道里作者關(guān)于CD34+來(lái)源的外泌體的描述。下圖是電鏡下外泌體形態(tài)，外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑分布在80nm左右。

下圖是外泌體的生物學(xué)，用western blot和流式檢測(cè)CD34,CD63和AnnexinV，TSG101外泌體標(biāo)注物，都呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

此外，這篇文章通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)CD34Exo對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管、活率及增殖功能的影響。

以上介紹的是作者自己課題組的前期工作，那么該領(lǐng)域其他的研究進(jìn)展怎樣呢？關(guān)于外泌體，我們目前已知外泌體中含有蛋白，miRNA等，不同的細(xì)胞及細(xì)胞外環(huán)境會(huì)影響外泌體的內(nèi)容物。且內(nèi)容物中既含有有益物質(zhì)也含有有害物質(zhì)。而對(duì)于外泌體是否有利于干細(xì)胞治療以及它的作用機(jī)制，是需要進(jìn)一步研究的。

本文基于前期研究結(jié)果，提出科學(xué)假說(shuō)CD34Exo促進(jìn)血管新生，并通過(guò)下肢缺血模型驗(yàn)證表型，高通量芯片篩選靶點(diǎn)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能，確定作用機(jī)制。最終證實(shí)科學(xué)假說(shuō)。

本文共有7張圖，可分為3部分。

圖1和圖2是文章的第一部分：體內(nèi)現(xiàn)象觀察。發(fā)現(xiàn)CD34Exo改善下肢缺血模型小鼠的血管再生和功能。

圖3是高通量測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行機(jī)制探索，確定作用靶點(diǎn)MiR-126。

而圖4-7是文章的主體部分，體內(nèi)和體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果。

圖A動(dòng)物表型的現(xiàn)象觀察，圖B是激光多普勒血流成像結(jié)果。從這兩個(gè)結(jié)果上看，CD34Exo改善下肢缺血模型小鼠的血管再生。

而圖c-e中，分別發(fā)現(xiàn)CD34Exo，CD34-CM和CD34+ Cells明顯改善壞死、再灌注、下肢運(yùn)動(dòng)功能和保肢評(píng)分。

圖2是在組織水平的檢測(cè)結(jié)果，在小鼠處死前采用BS-1植物凝集素注射，處死后對(duì)下肢組織包埋、切片。并采用抗植物凝集素一抗體和熒光二抗進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)CD34+ Cells，CD34Exo，CD34-CM明顯改善下肢組織的毛細(xì)血管密度。

圖1和圖2分別在動(dòng)物和組織水平發(fā)現(xiàn)CD34來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)血管新生。而接下來(lái)圖3試圖找出該現(xiàn)象的作用機(jī)制，作者選擇高通量的方法。通過(guò)蛋白和miRNA芯片檢測(cè)作用靶點(diǎn)。

作者采用與血管生成相關(guān)的蛋白array，檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)CD34+Exo組并沒(méi)有顯著的蛋白富集。說(shuō)明促血管新生現(xiàn)象不是通過(guò)調(diào)控蛋白表達(dá)的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

接下來(lái)又對(duì)miRNA進(jìn)行芯片檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是CD34+Cell還是CD34Exo中miR-126都呈現(xiàn)高表達(dá)，因此miR-126被選為研究靶點(diǎn)。

圖4是體內(nèi)/體外驗(yàn)證敲減miR-126 CD34Exo喪失血管生成功能。

其中圖A是在細(xì)胞中檢測(cè)miR-126表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EXO內(nèi)miR-126表達(dá)顯著高于細(xì)胞。而敲減CD34+細(xì)胞中的miR-126后，植物凝集素染色毛細(xì)血管長(zhǎng)度顯著降低。

體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，miR-126敲減后，下肢缺血沒(méi)有得到顯著性改善。

而在下肢運(yùn)動(dòng)功能和血管生成等分析，也可以發(fā)現(xiàn)miR-126是CD34Exo發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，敲低miR-126 CD34Exo將喪失促進(jìn)血管再生的能力。

圖5-圖7是的實(shí)驗(yàn)是本文能發(fā)在10分以上的重要原因。我們先看圖5，圖5作者主要回答的是miR-126表達(dá)升高，是CD34+外泌體促進(jìn)血管生成的原因還是結(jié)果呢？首先作者對(duì)miR-126和pri-miR-126進(jìn)行檢測(cè)，為什么選擇這兩個(gè)指標(biāo)呢？

我們知道當(dāng)我們向小鼠體內(nèi)注射CD34Exo后， 小鼠體內(nèi)的miR-126表達(dá)可能是注射的CD34Exo產(chǎn)生的也可能是小鼠體內(nèi)合成的，而pri-miR-126的產(chǎn)生僅可能來(lái)源與小鼠體內(nèi)合成。結(jié)果顯示，移植外泌體后，沒(méi)有引起體內(nèi)miR-126的合成。也就是說(shuō)miR-126升高是血管生成的因而不是果。

那么，miR-126的靶點(diǎn)是什么呢？SPRED1是血管生成的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。敲低miR-126后通過(guò)上調(diào)SPRED1，使得血管生成基因VEGF、 ANG1、 MMP9表達(dá)降低。

下邊作者主要是探討miR-126能否被CD34Exo攝取并傳遞至內(nèi)皮細(xì)胞。

在圖ABC采用的主要方法是Cy3標(biāo)記miRNA，檢測(cè)指標(biāo)包括FCM檢測(cè)Cy3+細(xì)胞，confocal檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞攝取CD34Exo。發(fā)現(xiàn)外泌體能夠攝入Cy3-miRNA，并將其傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞。

下邊是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用方法是R-PE標(biāo)記CD34細(xì)胞。檢測(cè)指標(biāo)包括FCM檢測(cè)R-PE+細(xì)胞，congocal檢測(cè)細(xì)胞攝取CD34Exo。分析結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞可以特意向吞食外泌體。

Confocal image結(jié)果顯示下肢缺血組織攝取R-PE-CD34Exo（Figure 7）。

那么內(nèi)皮細(xì)胞特意向吞食外泌體后，發(fā)生了什么變化呢？圖B FCM顯示CD31+內(nèi)皮細(xì)胞前向、側(cè)向角改變，提示細(xì)胞周期改變。

qRT-PCR檢測(cè)下肢缺血組織細(xì)胞周期蛋白表達(dá)也證實(shí)了以上結(jié)果。

在數(shù)據(jù)解析之后，饅頭老師為大家總結(jié)了本文的中用到的主要研究思路和方法。

第一步是外泌體的分離和鑒定。外泌體分離方法，通常采用的方式是超離。當(dāng)然SBI試劑盒也是不錯(cuò)的選擇。而在外泌體鑒定方面通常采用電鏡檢測(cè)形態(tài)，WB和FCM測(cè)定表面標(biāo)志物。標(biāo)記一般采用熒光染料。

第二部對(duì)外泌體靶標(biāo)的篩選方法，和一般的靶點(diǎn)篩選方法大致相同，通過(guò)芯片方式結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異分析，靶基因預(yù)測(cè)。最后通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第三部功能驗(yàn)證，對(duì)于下游功能驗(yàn)證中主要采用gain of function和loss of function方法。