人們對于毒品的神經生理學依賴原理還不了解，基于倫理道德的限制我們無法進行針對人的研究，利用大鼠可以克服這種阻礙，可以較為直觀地觀察毒品對其造成生理學依賴的神經生理學原因。 鴉片類藥物的使用障礙與海洛因戒斷期間持續(xù)的消極情緒類似，這種情緒會驅使出現(xiàn)戒斷癥狀的患者做出強迫性吸食和主動尋求藥物刺激的行為。針對大鼠的功能核磁成像（fMRI）可以識別出海洛因戒斷期間產生神經系統(tǒng)刺激激活的神經回路。使用任務態(tài)的分析方法，比較在吸食海洛因時與戒斷反應之間的大腦激活差異。我們發(fā)現(xiàn)下丘腦與杏仁核的激活與對海洛因的依賴程度相關。這或許與吸食者主動尋求并吸食毒品的消極情緒相關。本研究或為吸食毒品造成的神經依賴提供了新的神經生物學見解。本文發(fā)表在Journal of Clinical Investigation 當前美國正經歷毒品肆虐的危機。我們需要新的視角來認識鴉片類藥物的作用機理，以便有效地控制鴉片類藥物濫用（Opioid Use Disorder，OUD）并減少由于過量用藥致死的情況。我們認為吸毒者通過吸食鴉片類藥物來緩解或者消除戒斷反應中如焦躁、疼痛以及抑郁引發(fā)的負面情緒。而在臨床和臨床前的研究模型中，這些消極的環(huán)境刺激都會誘導患者自發(fā)地吸食鴉片類藥物。患者在遇到與鴉片類藥物相關的刺激時常會引發(fā)戒斷反應并喚醒對毒品的訴求。 而以鴉片類藥物為條件誘發(fā)的刺激可能會通過產生消極的情緒驅使患者去尋求毒品從而延續(xù)和恢復對鴉片類藥物的依賴，而消極的情緒也會通過吸食鴉片類藥物而得到緩解。識別這種支持了戒斷條件誘發(fā)的神經活動，或許可為OUD患者這種較差的、長期的神經可塑性的治療效果提供一種新的認識視角。因此本文假設有負責負面情緒處理的大腦回路會參與到長期持續(xù)的戒斷反應。基于大鼠藥物依賴的研究分析，我們發(fā)現(xiàn)大腦情緒系統(tǒng)在毒品誘發(fā)的這種戒斷反應確實會有參與。
被試信息：實驗選擇了21只成年的雄性Long-Evans大鼠。每兩到三只放一籠飼養(yǎng)，光照上每天12小時光照12小時黑暗處理，飼養(yǎng)到6周時插入筋脈導管，體重控制在250~275g，掃描時在靜脈輸入異氟烷進行麻醉。大約3到3.5個月時開始接受掃描。飼養(yǎng)時按照標準供給食物和水，實驗主要在黑暗中進行，只有少數(shù)較長的實驗會延續(xù)到白天。 用藥：海洛因鹽酸鹽，溶解于0.9%的無菌生理鹽水(60磅/公斤/0.1 ml)進行靜脈輸液。鹽酸納洛酮溶解于0.9%的無菌生理鹽水中，用于注射，注射量為1ml /kg和120°g/kg。 實驗設計：為驗證我們的假設，我們設計了一個行為模式實驗，實驗中誘發(fā)的刺激會與其引發(fā)的消極情緒相對應。首先我們對大鼠進行了分組，一組為長時接觸組（LgA，n=10）每天12小時，一組為短時接觸組（ShA,n=11），每天接觸1小時，按照60微克每公斤的劑量訓練其自行取食海洛因，以此模擬非依賴性和依賴性吸食海洛因的情況。LgA組大鼠的取藥量會有快速的增加，而ShA大鼠的取藥量則保持穩(wěn)定。在誘發(fā)條件控制上，大鼠會在用藥時注射30分鐘的生理鹽水或者納洛酮以形成條件反射。在一定的劑量內，在鴉片依賴大鼠體內納洛酮會與海洛因在鴉片受體上進行競爭，從而誘發(fā)戒斷相關的癥狀，但是不產生生理性的戒斷反應。在給藥處理上還會引入以檸檬和香草的氣味作為氣味誘發(fā)的條件刺激。這種搭配的刺激持續(xù)30分鐘，以配合納絡酮的作用時間。在氣味誘導的訓練后，ShA（短時接觸組）大鼠被放回籠子里，而LgA（長時接觸組）大鼠則在沒有氣味誘導的情況下完成12小時的訓練。Figure 1實驗設計流程
統(tǒng)計：使用雙因素方差分析對海洛因自我給藥的大腦激活進行統(tǒng)計分析，海洛因獲取(ShA和LgA)作為被試之間的分組因素，session或cue(生理鹽水和納洛酮耦合刺激)作為被試內部的因素。差異的顯著性水平控制在0.05。事后比較使用Bonferroni 方法對P值進行多重比較校正。行為實驗的統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 7軟件進行。其中1只LgA大鼠因導管通暢失敗被排除在研究之外。 對于fMRI數(shù)據(jù)分析，通過多元回歸分析去除了白質和腦脊液的平均信號。 我們進行了全腦2（海洛因接觸方式，ShA與LgA的接觸）×2（鹽水與納洛酮配對的氣味）×2（呈現(xiàn)順序第1和第2塊與第3和第4塊）的混合設計ANOVA的比較，使用掃描期間的平均呼吸頻率作為協(xié)變量。利用AFNI中的3dClustSim方法估計假陽性團塊的概率，用估計得到的閾值限制體素級別顯著性，限制團塊大小閾值，用于校正多重比較。經過校正的團塊大小為13，p<0.01。我們使用皮爾遜相關分析來檢驗以納洛酮作用期間海洛因的注射量為標準的行為指標和血氧信號的相關性，該信號由19個ROI中對氣味刺激的響應有顯著激活區(qū)域中提取。采用FDR校正對P值進行多重比較矯正，顯著性水平設置為 0.05。Figure 2 戒斷條件下負面情緒學習的大腦回路；A，隨著實驗進行兩組大鼠海洛因取食量的變化，可以看到LgA大鼠的注射量相對于ShA大鼠明顯的升高，B，不同納洛酮濃度誘導下，兩組大鼠海洛因注射量的變化比較，在納洛酮注射時，兩組大鼠的注射量是有顯著差異的，同時在納洛酮處理核分組之間存在交互作用， 結果發(fā)現(xiàn)在所有的組間，相對于鹽水誘導，納洛酮誘導的大鼠海洛因吸食量有了明顯的提高。而所有的組別對于氣味的條件刺激下海洛因的吸食量無明顯的增加。由于納洛酮相對于海洛因與鴉片類受體的親和力更強，使得其在LgA大鼠中產生了更強的戒斷反應。通過消除納洛酮和海洛因的控制而可緩解這種戒斷作用。對于納洛酮誘導組海洛因吸食量的增加或許可以解釋為納洛酮對獎賞系統(tǒng)造成了一定的損傷，同時隨著被試用藥量的逐漸增加也導致了其耐藥性的增強。 早期的研究表明，在LgA大鼠中，配合納洛酮治療的復合聽覺和視覺刺激增加了顱內自我刺激閾值，并在海洛因自我給藥過程中激發(fā)了被試繼續(xù)攝入海洛因的動機，這表明該刺激對納洛酮誘發(fā)的戒斷形成了條件反射。在這里，我們證實先前與納洛酮復合的嗅覺線索在LgA大鼠中同樣引起了海洛因攝入量的增加，但這種情況在ShA大鼠中并未出現(xiàn)。此外，與鹽水復合的氣味線索相比，在LgA大鼠中呈現(xiàn)的與納洛酮搭配的嗅覺條件刺激在海洛因快感消失后，激發(fā)了對海洛因更大的需求。 為了探索條件反射性戒斷背后的大腦回路，我們在功能磁共振成像(fMRI)采集小鼠最后一次提示條件反射自我給藥24小時后，將嗅覺線索單獨呈現(xiàn)給輕度麻醉的自發(fā)海洛因戒斷大鼠。實驗中我們可以使用輕度麻醉方法對大鼠進行處理，保證大鼠的神經血液耦合以及對氣味的感知和處理能力。在連續(xù)掃描過程中，氣味刺激的呈現(xiàn)使用block設計，同時其呼吸率也會隨著提示的呈現(xiàn)而波動。 我們以響應相對于基線的變化為主要分析變量，呼吸率為協(xié)變量，構建刺激呈現(xiàn)方式×海洛因接觸方式×分塊的2×2×2的混合方差分析模型，來查看各個條件的交互作用。在將大鼠大腦對齊到標準空間后，按照解剖學定義將其劃分為19個ROI構建大鼠的腦圖譜。隨后我們以處理期間海洛因注射的次數(shù)來衡量大鼠海洛因的依賴程度，并評估每個腦區(qū)的激活強弱與依賴程度之間的關系。在經過多重比較矯正之后，我們確定了下丘腦簇、下丘腦核以及杏仁核內測，杏仁核中央核及延伸杏仁核等腦區(qū)與海洛因依賴有較為明顯的相關關系。在這些腦區(qū)中，LgA大鼠里由于納洛酮復合誘發(fā)的腦血流信號出現(xiàn)了增加，而ShA大鼠則是減弱的。納洛酮復合條件處理期間海洛因的攝入與下丘腦簇和杏仁核對納洛酮復合誘發(fā)的腦血流響應存在相關性。條件反射中，戒斷反應越強烈這些相關區(qū)域的激活也越強。Figure 3不同腦區(qū)相對于基線血氧信號變化率的展示
在鴉片依賴的大鼠中，鴉片的戒斷反應會激活延伸杏仁核在內的情緒感知系統(tǒng)，基于人類的研究發(fā)現(xiàn)鴉片依賴會改變杏仁核的連接模式。在鴉片類藥物依賴的人類和大鼠中都有發(fā)現(xiàn)隨著藥物的停用引發(fā)下丘腦-垂體核-腎上腺HPA軸的激活。在鴉片類藥物戒斷過程中下丘腦室旁核的激活以及隨后的HPA軸的驅動可能是與鴉片類藥物過量攝入相關的一種早期失調。我們假設HPA軸的失調和延伸杏仁核的敏感性通過糖皮質激素信號傳導維持負面的情緒狀態(tài)。 這些結果表明：以前中性的刺激與鴉片類藥物戒斷相結合時，首先會產生激素壓力樣反應，從而激活延伸杏仁核的下丘腦外腦應激系統(tǒng)，形成消極情緒狀態(tài)的途徑，最后驅動人類中的渴望和復吸。
同時還有一些其他區(qū)域也表現(xiàn)出與下丘腦和杏仁核類似的激活情況。而這些區(qū)域中有許多與情緒學習有關，并被假設在成癮過程中會處于失調狀態(tài)。這些腦區(qū)包括外側下丘腦、丘腦背側核、腹外側丘腦和背側紋狀體。在OUD患者中，這些區(qū)域和杏仁核一同被海洛因的條件刺激激活。延伸的杏仁核通過與側下丘腦等區(qū)域的下部連接，促進了消極和積極情緒的形成。同時作為習慣學習回路的一部分，丘腦和腹側紋狀體與獎賞以及動機性的突顯刺激有明顯的關系。此外，在LgA大鼠中納洛酮復合刺激激活了連合前核(PRC)、導水管周圍灰質(PAG)、心室周圍灰質(PVG)和皮層前核，而在ShA大鼠中，這些區(qū)域并未激活。鹽水復合刺激下對LgA大鼠的對應腦區(qū)是未激活的，在解剖學上PRC和PAG/PVG與延申杏仁核、下丘腦和前額核相連，其在負面情緒的學習中起到關鍵作用。 最后，氣味符合刺激下激活了LgA大鼠下丘腦前部與韁核一致的區(qū)域，而在ShA大鼠中則是相反的。韁核能夠抑制中腦邊緣的多巴胺釋放，以調節(jié)情緒和動機的形成。韁核與下丘腦和杏仁核一同起著維持體內積極情緒的作用。雖然由于功能磁共振成像的空間分辨率和大鼠韁核過小的尺寸限制了我們確認其激活的可能性，但在負面的條件反應中韁核的潛在參與還值得進一步研究。Figure 4在條件反射期間的戒斷嚴重程度與下丘腦和杏仁核中響應納洛酮配對提示的大膽信號的變化相關。(A)從圖1C所示的大膽信號線索海洛因通路交互作用中提取下丘腦團塊。(B)注射鹽水條件下，下丘腦群中從基線到僅提示信號的粗信號變化的平均百分比。點圖顯示每個條件的單獨數(shù)據(jù)。(C)兩組海洛因獲取組在納洛酮條件作用期間海洛因攝入和下丘腦團塊對納洛酮配對提示的信號反應的散點圖(Pearson s相關性)。(D)杏仁核從圖1C中顯示的大膽信號線索海洛因進入交互作用中提取， 我們發(fā)現(xiàn)，條件性的海洛因激活會激發(fā)海洛因的攝入并影響以下丘腦應激性回路為主的參與負面情緒學習相關的大腦區(qū)域。這些回路與患有藥物提示反應性任務的OUD患者的fMRI結果一致并擴展了其發(fā)現(xiàn)。因此，我們認為，條件刺激線索可以通過消除厭惡狀態(tài)和產生積極激勵狀態(tài)來維持強迫性用藥，而且這兩種學習形式都有助于情緒過程中的非穩(wěn)態(tài)變化，從而使患者將用藥習慣持續(xù)下去。 暴露在條件性戒斷刺激下，可能會通過誘導一種強烈的厭惡壓力狀態(tài)來驅動OUD患者的對藥物的渴望，而這種狀態(tài)可以通過鴉片類藥物的使用來緩解。條件性退縮觸發(fā)的刺激可能與傳達學習的耐受性的刺激相同。因此，OUD患者在比如治療設施中進行了排毒或從監(jiān)禁中釋放后，在不熟悉的情況下或未以明確的提示使用鴉片類藥物并且其身體無法利用習得的補償機制或遇到條件性戒斷刺激時，特別容易因用藥過量而死亡。關鍵的是，美國食品和藥物管理局批準的3種針對鴉片受體用于OUD患者的藥物或不能完全緩解誘導條件下的戒斷。 總而言之，本實驗為了解和針對條件性戒斷和下游情緒背后的腦回路提供一種新穎的概念框架，可創(chuàng)新性地用于預防鴉片類藥物使用過量及其導致的死亡。同時通過fMRI檢查對藥物相關線索的心理反應提供了一個潛在的強有力的方法來理解導致和維持強迫性阿片類藥物使用的個體差異的原因。事實上，負面情緒學習大腦回路的功能障礙是追蹤OUD進展和緩解的一個潛在的生物標記。未來的研究需要在人類OUD患者腦中對這一回路做更多的了解。Heroin addiction engages negative emotional learning brain circuits in rats
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