一、細胞焦亡介紹
細胞焦亡（pyroptosis）是一種最近發(fā)現的細胞程序性死亡方式，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應。自2015年以來，邵峰院士等人發(fā)現，caspase-1和caspase-11/4/5是通過切割一個叫做Gasdermin-D（GSDMD）的蛋白而誘發(fā)細胞焦亡的，GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，釋放出其N端結構域，該結構域具有結合膜脂并在細胞膜上打孔的活性，這樣就導致細胞滲透壓的變化而發(fā)生脹大直至最終細胞膜的破裂（Shi et al., Nature 2015；Ding et al., Nature 2016）。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應，在拮抗感染和內源危險信號中發(fā)揮重要作用。細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經系統(tǒng)相關疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，對細胞焦亡的深入研究有助于認識其在相關疾病發(fā)生發(fā)展和轉歸中的作用，為臨床防治提供新思路。近幾年，細胞焦亡的研究熱度迅猛上升，已成功吸引科學家們的眼球，一躍成為熱門研究領域。
細胞焦亡（pyroptosis）、細胞凋亡（apoptosis）、細胞自噬（autophagy）、細胞壞死性凋亡(necroptosis)都是程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）的表現形式，程序性細胞死亡是指細胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程。細胞凋亡由凋亡性caspase（Caspase-2, 3, 6, 7, 8, 9或人類caspase-10）介導。與細胞凋亡相比，細胞焦亡是由炎癥性caspase（Caspase-1, 4, 5, 11）誘導的一類壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡。相比于細胞凋亡，細胞焦亡發(fā)生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。由于細胞焦亡需要炎癥性caspase的參與，其與另一種壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡方式—壞死性凋亡不一樣，壞死性凋亡發(fā)生不需要caspase的參與。
細胞焦亡與其它程序性死亡和非程序性死亡的差異
細胞凋亡（apoptosis） （圖1） | 細胞自噬（autophagy） | 細胞焦亡（pyroptosis） | 細胞壞死性凋亡 (necroptosis) （圖1） | 細胞壞死（necrosis） | |
性質 | 程序性 | 程序性 | 程序性 | 程序性 | 非程序性 |
誘因 | 生理條件下的基因調控 | 營養(yǎng)缺乏或激素誘導 | 病理性刺激 | 病理性變化或劇烈損傷 | 病理性變化或劇烈損傷 |
細胞形態(tài) | 縮小 | 產生空泡 | 細胞膨大，變形 | 細胞膨大，變形 | 細胞膨大，變形 |
細胞膜 | 膜結構完整 | 膜結構的完整 | 細胞膜破裂 | 細胞膜破裂 | 細胞膜破裂 |
細胞器 | 完整 | 被自噬體吞噬，最終被溶酶體消化 | 變形 | 變形或腫大 | 變形或腫大 |
DNA | 降解為180-200bp及其整數倍的片段 | 隨機降解 | 隨機降解 | 隨機降解 | 隨機降解 |
細胞焦亡（pyroptosis）
細胞凋亡（apoptosis）
圖1. Chen X , He W T , Hu L , et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis[J]. Cell Research, 2016, 26(9):1007-1020.
二、細胞焦亡的特點
細胞焦亡發(fā)生時，細胞會發(fā)生腫脹，在細胞破裂之前，細胞上形成凸出物（圖1，細胞焦亡Early），之后細胞膜上形成孔隙，使細胞膜失去完整性，釋放內容物，引起炎癥反應，此時，細胞核位于細胞中央（圖1，細胞焦亡Late），隨著形態(tài)學的改變，細胞核固縮，DNA斷裂。
細胞焦亡過程，具有caspase-1依賴性。在外界條件的刺激下，caspase-1前體可以與模式識別受體NLRP1、NLRP3等通過接頭蛋白ASC變?yōu)橐粋€高分子復合物，即炎癥小體，也稱依賴caspase-1的炎癥小體。細胞在caspase-1激活同時會釋放出炎性因子白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和IL-18，進而吸引更多的炎性細胞，加重炎癥反應。
焦亡發(fā)生時形成孔隙，它允許細胞質的內容物，如乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）和炎性細胞因子釋放，熒光標記的膜聯蛋白V、7-氨基放線菌D或碘化丙啶進入細胞。
三、細胞焦亡的信號通路
細胞焦亡屬于炎癥性死亡途徑，按激活機制，可分為Caspase-1依賴和不依賴兩種途徑。兩種途徑都是通過切割GSDMD后形成N端游離的肽段，這一肽段會誘導細胞形成孔道并導致細胞破裂，釋放胞質成分。兩種途徑都能同時誘導IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激活Caspase-1。
細胞焦亡的機制
Zhaolin, Z., et al., Role of pyroptosis in cardiovascular disease. Cell Prolif, 2019. 52(2): p. e12563.
炎性小體激活的分子機制與焦亡的誘導發(fā)生需要兩步機制：第一步是啟動步驟，促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等的轉錄生成。第二步是激活炎性復合物，炎性復合物包括NLR（NOD-like receptors，胞漿內感受器）蛋白家族成員、銜接蛋白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1，其中NLR蛋白家族成員中NLRP3是細胞焦亡中的主要炎性復合物。
（1）細胞焦亡發(fā)生的經典通路：在病原體、細菌等信號的刺激下，細胞內的NLR識別這些信號，通過銜接蛋白ASC與Pro-Caspase-1結合，激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GasderminD，形成GasderminD氮端和碳端，GasderminD氮端就會和細胞膜上的磷脂蛋白結合，形成孔洞，釋放內容物，誘導焦亡發(fā)生；另一方面，活化的Caspase-1對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，造成炎癥反應；
（2）依賴Caspase-4、5、11的非經典途徑：以炎性刺激因子LPS為例，沒有通過受體直接進入細胞質內，Caspase 其它家族成員如Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD，誘導焦亡發(fā)生；另一方面，誘導Caspase-1的活化，對IL-1β和IL-18的前體進行切割，造成炎癥反應。
四、細胞焦亡的研究方法
細胞焦亡的機制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關鍵信號，因此證明所誘發(fā)的細胞死亡方式是否為細胞焦亡，需要幾個關鍵的實驗證據：
（1） GSDMD的切割 （Western檢測）；
（2） Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11。（Western檢測）；
（3） IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放 （Western，ELISA等）；
（4）細胞形態(tài)學檢測（CCK-8等）；
（5）染色質完整性檢測 （Tunel等）。
完整檢測方式如下：
1、形態(tài)變化
（1）掃描電鏡觀察細胞形態(tài)；
（2）免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）；
（3）Tunel檢測。
2、檢測焦亡相關基因及蛋白
（1）q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關基因或蛋白的表達水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；
（2）ELISA試劑盒檢測炎癥因子的水平；
（3）CCK8法測定細胞活力；
（4）免疫組化檢測組織蛋白的表達。
五、細胞焦亡相關的研究領域
細胞焦亡是機體重要的免疫反應，在拮抗感染和內源性危險信號中發(fā)揮重要作用。廣泛參與腫瘤、感染性疾病、代謝性疾病、神經系統(tǒng)相關疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展。
1、細胞焦亡與感染性疾病
在病原體感染時，適度的細胞焦亡可清除致病微生物，而過度的細胞焦亡在導致細胞死亡的同時，釋放炎癥因子，擴大炎癥反應，造成發(fā)熱，低血壓、敗血癥等癥狀。以敗血癥為例，敗血癥是由致病菌侵入血液系統(tǒng)，并在其中生長繁殖，產生毒素，引起全身性感染，最新研究表明，細胞自噬相關基因Atg7沉默后，可激活細胞焦亡途徑。
2、細胞焦亡與代謝性疾病或心血管疾病
（1）因代謝障礙或代謝旺盛等原因引起的疾病稱為代謝性疾病，常見的有糖尿病、痛風、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病為例，由心肌細胞死亡引起，最新的研究顯示高血糖可以造成活性氧的產生增加，進而上調NF-κB和TXNIP，NF-κB又可以上調NLRP3、IL-1β前體以及IL-18前體的表達；TXNIP通過改變NLRP3的結構激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導心肌細胞膜穿孔、破裂，釋放內容物，引起炎癥反應；另一方面，活化的Caspase-1對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細胞聚集，擴大炎癥反應。
（2）通過小鼠心肌炎動物模型研究發(fā)現， 1, 25-二羥基維生素D3能夠抑制心肌細胞焦亡信號通路阻止心肌細胞死亡，使1, 25-二羥基維生素D3治療后的心肌炎小鼠病情狀況普遍得以改善。Cholecalciterol cholesterolemulsion attenuates experimental autoimmune myocarditis in mice via inhibitionof the pyroptosis signaling pathway.
（3）研究發(fā)現，高血糖環(huán)境下miRNA-9可通過作用于蛋白ELAVL1 (ELAV-like protein 1) ，繼而抑制caspase-1及IL-1β在心臟及心肌細胞中的表達，阻遏高糖誘導的心肌細胞焦亡，這為糖尿病心肌病提供了可能的治療靶點。
3、細胞焦亡與神經系統(tǒng)疾病
神經系統(tǒng)疾病包括腦損傷，癲癇等。以癲癇為例，研究發(fā)現，癲癇發(fā)作可通過鉀離子外流等途徑激活NLRP1炎癥體，進而激活依賴Caspase-1的焦亡途徑，導致癲癇進一步發(fā)展。
4、細胞焦亡與動脈粥樣硬化
（1）在動脈粥樣硬化的發(fā)展中，炎癥被認為是啟動和驅動動脈粥樣硬化的主要因素。在高血脂、氧化修飾的低密度脂蛋白等幾次下，激活Caspase-1，介導血管內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞的焦亡與炎癥反應，導致血管擴張功能障礙、壞死中心的形成，粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，最終造成動脈粥樣硬化。
（2）研究發(fā)現NLRP3相關的下游分子 (ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18) 在動脈粥樣硬化斑塊中的表達明顯高于非動脈粥樣硬化血管，且其表達的上調與斑塊的脆性密切相關，提示NLRP3炎性小體激活介導動脈粥樣硬化病變的演進。NLRP3 Inflammasome Expressionand Activation in Human Atherosclerosis.
5、細胞焦亡與腫瘤
（1）研究發(fā)現，在ROS及細胞毒素的作用下，JNK激酶被激活并轉移到細胞核內，促進焦亡相關基因的表達，啟動焦亡的形成，控制腫瘤的發(fā)展。
（2）一項采用5-氟尿嘧啶處理胃癌細胞系以探索胃癌化療機制的研究發(fā)現，gasdermin家族中的GSDME能將化療藥物誘導的caspase-3依賴的細胞凋亡轉換胃癌細胞焦亡，進而達到治療目的。GSDME mediatescaspase-3-dependent pyroptosis in gastric cancer.
6、細胞焦亡與腎相關疾病
（1）研究發(fā)現，長鏈非編碼RNA MALAT1 參與了糖尿病腎病腎小管上皮細胞的焦亡過程。MALAT1 抑制了 mir-23c 的表達，mir-23c 的下調促進了其靶基因 ELAVL1 的表達，ELAVL1 是一種細胞焦亡相關蛋白，ELAVL1 表達增加后可促進下游 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1 的生成，最終導致腎臟炎癥反應和細胞焦亡。Long noncodingRNA MALAT1 regulates renal tubular epithelial pyroptosis by modulated miR-23ctargeting of ELAVL1 in diabetic nephropathy.
（2）近年來研究發(fā)現，細胞焦亡同樣參與了腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現 NLRP3 基因敲除的 UUO 小鼠與野生型相比，其活化的 Casapse-1/IL-18/IL-1β明顯減少，且腎小球的損傷及小管間質纖維化明顯減輕。NLRP3 deficiency attenuatesrenal fibrosis and ameliorates mitochondrial dysfunction in a mouse unilateralureteral obstruction model of chronic kidney disease.
（3）晶體相關性腎病研究發(fā)現以含 100 μg/mL尿酸培養(yǎng)液培養(yǎng)腎小管上皮細胞發(fā)現 TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達的增加，予以 TLR4 的阻滯劑TAK242 干預后 NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達明顯減少，說明尿酸可通過 TLR4 激活 NLRP3 及下游焦亡信號因子，導致腎臟炎癥反應及細胞焦亡。
Soluble uric acid increases NALP3 inflammasome and interleukin-1β expression in human primary renal proximaltubule epithelial cells through the Toll-like receptor 4-mediated pathway.
7、細胞焦亡與lncRNA
最近的研究表明，lncRNA在調節(jié)細胞焦亡中具有重要作用， 通過直接或間接作用于與細胞焦亡信號通路相關的蛋白質，lncRNA參與了與心血管疾病，腎臟疾病，免疫疾病和其他疾病有關的病理過程。
Long non-coding RNAs and pyroptosis.
8、重磅研究進展
（1）Science：ESCRT膜修復系統(tǒng)是細胞焦亡過程的補救機制
2018年11月23日，Science發(fā)表了一篇細胞焦亡機制相關的重要研究論文，報道細胞發(fā)生焦亡激活的時候，胞內鈣離子流會因為GSDMD孔道而發(fā)生變化，細胞以此為信號，募集ESCRT復合物進行損傷膜系統(tǒng)的修復。抑制ESCRT-III可顯著提高細胞焦亡的比例。本文的報道發(fā)現了一種內源的細胞焦亡過程中的補救機制，是細胞焦亡機制的重要進展。
（2）Nature：化療藥物通過Caspase-3切割GSDME誘導細胞焦亡
2017年5月1日，Nature發(fā)表了邵峰的一項重要研究成果，報道發(fā)現化療藥物誘導Caspase-3切割GSDME，實現細胞凋亡向細胞焦亡的轉變。被Caspase-3切割后的GSDME的N端多肽也可以形成孔道，最終導致炎癥性細胞因子的釋放。GSDME在正常組織中有一定的表達水平，但經常在腫瘤細胞中表達沉默。GSDME敲除小鼠對一些化療藥物（如順鉑）誘發(fā)的組織損傷具有一定的抵抗能力。本文的工作首次發(fā)現了細胞凋亡的執(zhí)行者Caspase-3切割GSDMD同家族的另一成員GSDME，可以實現細胞凋亡-細胞焦亡的轉變。
