大昌華嘉Particle Metrix，納米顆粒跟蹤分析儀
太長不看版：德州大學MD安德森癌癥中心的副院長洪明奇教授研究團隊最近在Cell Research雜志發(fā)表文章，報道了腫瘤細胞分泌的外泌體中不僅存在PD-L1，而且同樣抑制抗腫瘤免疫；通過敲除Rab27a或抑制劑GW4869治療抑制含PD-L1的外泌體的分泌可發(fā)揮強大的抗癌作用。該研究結果顯示，抑制腫瘤外泌體PD-L1的分泌比現在火得不得了的PD-L1抗體療法都要更厲害一點；當抑制外泌體分泌與PD-L1抗體治療相結合時，效果最佳。
腫瘤-微環(huán)境相互作用在腫瘤進展、轉移和治療抵抗中發(fā)揮重要作用，并且越來越多的證據表明，腫瘤細胞衍生的外泌體可以通過轉移分子（例如microRNA、mRNA和蛋白質）來系統地調節(jié)或重編程腫瘤微環(huán)境。PD-L1是一種經典的免疫表面蛋白，通過與受體程序性細胞死亡-1（PD-1）結合，抑制T細胞的抗腫瘤功能，有效保護腫瘤免受免疫監(jiān)視。據報道，外泌體含有某些類型的蛋白質，包括促進癌癥轉移的膜蛋白，例如EGFR和MET。作為膜結合蛋白，PD-L1是否存在于癌細胞衍生的外泌體中，是否在腫瘤進展中發(fā)揮作用仍然未知。
研究人員通過連續(xù)離心從具有PD-L1表達或PD-L1敲除（PD-L1 KO）的MDA-MB-231（231）人乳腺癌細胞和4T1小鼠乳腺腫瘤細胞的細胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體。透射電鏡顯示這些外泌體通常是球形的，并且是膜包封的，尺寸為30-100 nm。在從表達PD-L1的人乳腺癌細胞（231-PD-L1）和小鼠乳腺癌細胞（4T1-PD-L1）的培養(yǎng)上清中分離的外泌體中檢測到PD-L1；在231-PD-L1 KO或4T1-PD-L1KO細胞培養(yǎng)上清中提取的外泌體雖然具有相似水平的外泌體標志蛋白CD63和CD81，但檢測不到PD-L1表達。值得注意的是，外泌體分泌抑制劑GW4869的處理減少了231細胞中外泌體的產生（如外泌體標志蛋白CD63和CD81的減少或外泌體蛋白總量的減少）以及外泌體中PD-L1的水平，但對細胞裂解物中的PD-L1表達沒有影響。此外，體外結合測定顯示PD-1-Fc蛋白同時下拉231-PD-L1衍生的外泌體中的PD-L1（exo-PD-L1）和CD81。231細胞的免疫熒光（IF）染色和人乳腺癌組織的免疫組織化學（IHC）雙染色證明PD-L1和CD63在多泡體（MVB）中的共定位，這是釋放前細胞內外泌體的前體形式。這些數據進一步支持體外和體內的外泌體中存在PD-L1。
圖：PD-L1存在于外泌體中，在乳腺腫瘤生長中起重要作用。
為了評估exo-PD-L1的生物學功能，研究人員首先想知道的是它是否可以將PD-L1轉移至具有低（MCF-7）或無PD-L1表達的其他細胞（BT549-PD-L1 KO）。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉移至MCF7或BT549-PD-L1 KO細胞。 PD-L1蛋白的獲得不是PD-L1基因表達的結果，因為這些細胞中缺乏PD-L1 mRNA。他們還建立了231-PD-L1 EGFP細胞，并在視覺上證明了231-PD-L1 EGFP衍生的外泌體向BT549細胞轉移PD-L1 EGFP。為了驗證這是否也在體內發(fā)生，他們將小鼠4T1-PD-L1 KO細胞與來自4T1-PD-L1 Flag（EX-PD-L1 Flag）、4T1-PD-L1KO（EX-PD-L1 KO）的外泌體或PBS共注射進入BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊。5天后收獲腫瘤。腫瘤組織切片的IF染色顯示EX-PD-L1 Flag而不是EX-PD-L1 KO使得4T1-PD-L1 KO細胞呈PD-L1 Flag陽性。重要的是，流式細胞術分析的結果進一步揭示由外泌體轉運的PD-L1位于靶細胞的表面上并且能夠結合PD-1。這些結果表明外泌體能夠將功能性PD-L1轉移至其他細胞。
鑒于外泌體的PD-L1可以直接結合PD-1，他們接下來檢查外泌體PD-L1是否影響T細胞功能。研究結果顯示，exo-PD-L1顯著抑制T細胞對BT549-PD-L1 KO細胞的殺傷作用。接下來，為了探索exo-PD-L1是否抑制CD3/CD28觸發(fā)的T細胞激活信號通路，他們通過用植物血凝素（PHA）處理外周血單核細胞（PBMC）來誘導PD-1表達產生T細胞母細胞。結果表明exo-PD-L1以劑量依賴的方式顯著抑制CD3/CD28誘導的T細胞的ERK磷酸化和NF-κB活化，以及PHA誘導的白細胞介素-2（IL-2）分泌，所有這些都是T細胞活化的指標。此外，來自其他癌細胞系的exo-PD-L1，如結腸（RKO）和肺（ HCC827）癌細胞在阻斷T細胞活化中具有相似的功能?？傊?，這些數據支持外泌體PD-L1抑制T細胞活化。
接下來，為了評估exo-PD-L1在腫瘤微環(huán)境和體內腫瘤進展中的作用，他們測量了與EX-PD-L1 Flag、EX-PD-L1 KO或PBS共注射的4T1-PD-L1 KO細胞的腫瘤生長。與之前的報道一致，4T1-PD-L1 KO細胞中的PD-L1缺乏導致腫瘤顯著消退；然而，EX-PD-L1 Flag而非EX-PD-L1 KO顯著恢復了4T1-PD-L1 KO細胞的腫瘤生長。然后他們將4T1-PD-L1 KO細胞暴露于增加量的EX-PD-L1 Flag，結果顯示EX-PD-L1 Flag以劑量依賴性方式促進腫瘤生長。此外，與EX-PD-L1 KO或PBS共注射相比，具有EX-PD-L1 Flag共注射的4T1-PD-L1 KO腫瘤表現出更少的顆粒酶B表達，表明腫瘤區(qū)域中細胞毒性T細胞活性降低。這些結果表明EX-PD-L1通過抑制T細胞顆粒酶B的分泌來保護和促進體內腫瘤生長。這些發(fā)現與上述體外研究一致，體內結果同樣證明外泌體的PD-L1可與PD-1結合并抑制T細胞殺傷活性。
上述IHC染色的結果顯示PD-L1和外泌體標記物CD63在人腫瘤組織樣品中的MVB中的共定位，他們試圖進一步確定它們的共定位是否與患者乳腺癌的發(fā)展階段有關。對一組人乳腺癌組織芯片的分析表明，與疾病的較高階段相關的PD-L1-CD63共定位水平較高，這與最近關于外泌體中PD-L1水平相關的報道一致。根據上述結果，他們假設生長的腫瘤繼續(xù)將exo-PD-L1分泌到腫瘤微環(huán)境中使T細胞功能失活，這可能誘導免疫治療抵抗。為了探索靶向外泌體分泌增強免疫療法功效的可能性，他們在小鼠模型中用外泌體分泌抑制劑GW4869與PD-L1抗體組合治療腫瘤。首先，結果顯示GW4869抑制4T1小鼠乳腺癌細胞的外泌體分泌。GW4869對外泌體分泌的抑制抑制BALB/c小鼠中的4T1腫瘤生長，但體外和免疫缺陷裸鼠中4T1細胞生長不受抑制，表明GW4869治療本身不抑制4T1腫瘤生長，但可能通過調節(jié)抗腫瘤免疫，包括抑制exo-PD-L1分泌。因此，如所預期的，GW4869治療顯著增強了4T1腫瘤生長抑制中的抗PD-L1治療功效。此外，為了特異性抑制4T1細胞的外泌體分泌，他們構建了Tet-on誘導型Rab27a敲低4T1細胞系。與先前報道一致，通過Dox處理敲低Rab27a顯著抑制外泌體分泌，并且結果進一步顯示Rab27a的敲低顯著抑制4T1腫瘤生長。與GW4869治療相似，腫瘤細胞中Rab27a敲低對外泌體分泌的特異性抑制顯著增強了抗PD-L1治療功效。因此，腫瘤細胞中藥理學抑制劑（GW4869）和遺傳方法（Rab27a敲低）對外泌體分泌的抑制顯著抑制4T1腫瘤生長并增強抗PD-L1治療功效。值得一提的是，通過敲除Rab27a或抑制劑GW4869治療與抗PD-L1抗體治療相比，腫瘤抑制作用相對深遠，表明腫瘤細胞中分泌的外泌體PD-L1的阻斷顯著促進抗腫瘤免疫。此外，兩者的結合導致更強的腫瘤抑制。
此外，盡管已經證明外泌體將PD-L1從PD-L1陽性轉運到PD-L1陰性乳腺癌細胞，并且exo-PD-L1與T細胞上的PD-1結合以抑制T細胞活化和殺傷活性，據報道人類骨髓APC也表達PD-L1并且對免疫療法有重要貢獻。因此，他們還測試了含有PD-L1的外泌體是否可以將PD-L1轉運至骨髓APC。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉移至人單核細胞系THP1（巨噬細胞和DC的前體）。流式細胞術分析的結果進一步揭示外泌體可以在體外將PD-L1 EGFP轉移至人巨噬細胞和PBMC中的DC。在體內，IF染色結果顯示EX-PD-L1 Flag使腫瘤浸潤的巨噬細胞PD-L1 Flag呈陽性；然而，他們沒有觀察到DC中的陽性染色。目前尚不清楚為什么體內外泌體對PD-L1向DC的轉移效率與巨噬細胞相比較低。這可能是由于較少量的DC和/或一些未知機制降低了腫瘤微環(huán)境中的效率。然而，結果表明PD-L1可以通過腫瘤微環(huán)境中含有PD-L1的外泌體轉移到多種細胞類型，包括腫瘤細胞、巨噬細胞和DC（至少在體外）。因此，外泌體似乎充當運輸載體以將PD-L1遞送到腫瘤微環(huán)境中的不同細胞類型中以調節(jié)免疫監(jiān)視。盡管尚不清楚表達PD-L1的巨噬細胞或DC是否也可能分泌外泌體-PD-L1，但結果表明，Rab27a敲除腫瘤細胞中外泌體分泌的阻斷可抑制4T1腫瘤生長，GW4869治療有類似作用。總之，該研究表明，來自腫瘤細胞的外泌體PD-L1在調節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫監(jiān)視中起重要作用。
總的來說，目前的研究結果表明PD-L1通過其在外泌體中的存在發(fā)揮被動保護作用，同時也在主動防御中起作用，并且含有PD-L1的外泌體減弱腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫。此外，結果表明，外泌體PD-L1分泌的阻斷有助于抗腫瘤免疫，并且外泌體分泌抑制和抗PD-L1治療的組合具有改善臨床中抗腫瘤反應的潛力。
最后，小編覺得很厲害的是，通過2種抑制外泌體分泌的方法抑制外泌體PD-L1的分泌所達到的抑制腫瘤生長的效果比現在火得不得了的抗PD-L1療法都要更厲害一點。更不用說抑制外泌體分泌與抗PD-L1抗體治療相結合的效果啦，好得不得了~~~
參考文獻：
Yang,Y., et al. (2018). "Exosomal PD-L1 harbors active defense function to suppressT cell killing of breast cancer cells and promote tumor growth." CellRes. https://doi.org/10.1038/s41422-018-0060-4
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