作者：半知菌目
編輯：北京中侖工業(yè)微生物研究院
序言：從70%到50-200%，2015年版《中國藥典》的回收率標(biāo)準(zhǔn)降低了嗎？且聽半知菌目娓娓道來......
一、回收率的規(guī)定
中國藥典2015年版4部，對(duì)于回收率是這樣規(guī)定的：接種不大于100cfu 每一試驗(yàn)菌株平行制備2 個(gè)平皿。檢培被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0. 5～2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。
這段話中包含如下的信息：
1.回收率：50～200%；
2.接菌量小于100cfu。
微生物檢驗(yàn)員應(yīng)該都不會(huì)忘記中國藥典2010年版及之前對(duì)于回收率的要求吧：
1. 回收率大于70%；
2. 接種量：50～100cfu。
為什么中國藥典會(huì)做出這樣的改變？中國藥典對(duì)回收率標(biāo)準(zhǔn)的改變，是標(biāo)準(zhǔn)降低了嗎？
回收率，做為評(píng)價(jià)培養(yǎng)基的關(guān)鍵指標(biāo)，它的合格與否直接決定了培養(yǎng)基的主要指標(biāo)促生長能力的優(yōu)劣。而回收率測定，又與測試的標(biāo)準(zhǔn)菌株息息相關(guān)、密不可分。
二、微生物生長曲線
我們從微生物的生長曲線開始談起，
單細(xì)胞微生物接種純種到一定容積的液體培養(yǎng)基后，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定細(xì)胞數(shù)量。以細(xì)胞增長數(shù)目的對(duì)數(shù)做縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間做橫坐標(biāo)，繪制一條如上圖所示的曲線，我們稱這條曲線為細(xì)菌的生長曲線。曲線顯示了細(xì)菌的生長繁殖的4個(gè)時(shí)期：遲緩期，對(duì)數(shù)生長期，穩(wěn)定期，衰亡期。
用來測試培養(yǎng)基回收率的菌懸液，即接種涂布在固體培養(yǎng)基表面那0.1毫升、小于100cfu的測試菌，必然包含了上述遲緩期，對(duì)數(shù)生長期，穩(wěn)定期，衰亡期的微生物，其生長性能，在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出的生長活性是有所不同的。那100cfu個(gè)微生物中，處于對(duì)數(shù)生長期，穩(wěn)定期的，其生長活性必然旺盛，而處于遲緩期、衰亡期的微生物，其生長活性必定不如前者。
三、回收率的合格標(biāo)準(zhǔn)
因此，對(duì)于測試培養(yǎng)基來說，回收率合格與否，一定要與對(duì)照培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）生長的同種測試菌種的數(shù)量來對(duì)比，回收率測試的合格標(biāo)準(zhǔn)一定是一個(gè)動(dòng)態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)，測試培養(yǎng)基的合格標(biāo)準(zhǔn)就是對(duì)照培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）的上下2倍范圍。
反映在回收率的合格標(biāo)準(zhǔn)上，50～200%的合格范圍，直接決定因素就是對(duì)照培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）上生長的微生物數(shù)量，隨每次檢測的不同而呈現(xiàn)出一定幅度的變化。而不是給回收率規(guī)定一個(gè)一成不變的固定數(shù)值。每一次對(duì)測試培養(yǎng)基回收率試驗(yàn)與對(duì)照培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）的比值決定了這次回收率的合格的上下限，并沒有設(shè)定一個(gè)單一的，固定不變的合格限度。這樣一個(gè)動(dòng)態(tài)的回收率判定的規(guī)定，更加符合微生物的生長特性，而且在實(shí)際的培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)檢測活動(dòng)中更有實(shí)際意義。
四、回收率的高低
那么回收率的高低說明什么呢？對(duì)于同一批次培養(yǎng)基，2次回收率測試如果分別是51%，99%，說明了什么？
如果回收率測試方法正確，回收率數(shù)值的高低第一不可以評(píng)價(jià)培養(yǎng)基質(zhì)量優(yōu)劣；第二不可以評(píng)判檢驗(yàn)員測試水平高低。如果2次測試同一批培養(yǎng)基，分別得出51%，99%兩個(gè)回收率數(shù)據(jù)，或者兩位檢驗(yàn)員對(duì)一個(gè)批次培養(yǎng)基測試分別得出51%，99%兩個(gè)回收率數(shù)據(jù)，只要測試方法正確，這兩個(gè)回收率數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)這批次培養(yǎng)基第一都是合格的，第二兩個(gè)數(shù)據(jù)是等效的。而不是回收率高，培養(yǎng)基質(zhì)量好或檢驗(yàn)員水平高；回收率低，培養(yǎng)基質(zhì)量差或檢驗(yàn)員水平低。因此，這種情況下回收率數(shù)字的高與低，反映出了測試菌懸液的生長狀態(tài)，畢竟微生物是有生命的。
回收率試驗(yàn)其實(shí)就是用“活”的微生物來測試“死”的培養(yǎng)基，要證明“死”的培養(yǎng)基合格，如何操作“活”的微生物成了關(guān)鍵。
五、回收率的測試方法
回收率測試方法，對(duì)于固體培養(yǎng)基而言，就是中國藥典2015年版新引入的“涂布法”。涂布法就是在測試固體培養(yǎng)基表面涂布小于100cfu測試微生物，按照規(guī)定的方法培養(yǎng)后計(jì)數(shù)并計(jì)算回收率。該方法的關(guān)鍵操作有兩點(diǎn)：
第一，菌懸液的制備與稀釋；
第二，涂布方法。
第一點(diǎn)藥典上已經(jīng)有了詳細(xì)說明。
涂布方法，藥典只簡單說了在測試培養(yǎng)基上加入不少于0.1mL菌懸液（不超過100cfu微生物）。在涂布法測試中，0.1mL菌懸液和不超過100cfu微生物，這兩個(gè)數(shù)字都必須滿足嗎？
要回答這個(gè)問題，首先要明確的是對(duì)于測試培養(yǎng)基的回收率來說，0.1mL菌懸液和不超過100cfu這兩個(gè)數(shù)據(jù)要求，對(duì)回收率而言，那個(gè)更關(guān)鍵呢？毫無疑問，回收率測試就是要考察涂布在培養(yǎng)基上那100cfu的微生物，測試培養(yǎng)基的支持生長能力，測試培養(yǎng)基的回收率即由此決定。而0.1mL毫升的接菌數(shù)量，對(duì)于不同規(guī)格的培養(yǎng)基來說，在保證涂布均一性的提前下，90mm平板加入0.1mL是可以的，對(duì)于150mm平板，要保證涂布的均一性，加入0.1mL是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，加菌量至少需要0.2-0.3mL；而對(duì)于55mm的接觸平板，因?yàn)槠浔砻娉尸F(xiàn)為凸面，且表面積不足90mm平板的40%，若仍加入0.1mL涂布，加菌后未等涂布均勻菌懸液就會(huì)溢出培養(yǎng)基表面了，極容易出現(xiàn)回收率非常低下的測試結(jié)果，因此對(duì)于55mm的接觸平板，回收率測試時(shí)的加菌量應(yīng)該少于0.1mL，以0.05mL為宜。但是，對(duì)于不同規(guī)格的培養(yǎng)基，涂布法的加菌量可以不同，但加菌的數(shù)量都應(yīng)該遵循不超過100cfu這一原則。
回收率測試試驗(yàn)，對(duì)于不同培養(yǎng)基，不同配制時(shí)間的培養(yǎng)基，涂布的方法也是所不同
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