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引言

MetaboAnalyst是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的綜合性工具套件，旨在幫助用戶輕松地進(jìn)行代謝組數(shù)據(jù)分析、可視化和功能注釋。從2009年的MetaboAnalyst 1.0采用單一模塊實(shí)現(xiàn)了代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析起，MetaboAnalyst不斷更新，分別在2012年和2015年發(fā)布了2.0和3.0版本，以滿足代謝組學(xué)研究不斷發(fā)展的需要。而且為了更好地應(yīng)對(duì)不斷增長(zhǎng)的用戶需求，MetaboAnalyst已經(jīng)遷移到Google云服務(wù)器。在過(guò)去的12個(gè)月中，MetaboAnalyst已經(jīng)處理了來(lái)自60 000用戶的超過(guò)180萬(wàn)個(gè)工作。2017年，至少四分之一的代謝組學(xué)研究都使用了MetaboAnalyst，說(shuō)明其已經(jīng)成為代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析的首選工具之一。

MetaboAnalyst今年的更新改善了用戶界面、提高了可重復(fù)性/透明度，實(shí)現(xiàn)了支持批量處理、提供改進(jìn)的來(lái)自非靶向質(zhì)譜(MS)數(shù)據(jù)的通路注釋、支持meta分析和多組學(xué)分析等功能，并擴(kuò)展了基礎(chǔ)知識(shí)庫(kù)，也支持本地安裝使用。今年更新的主要特點(diǎn)包括：

·同步發(fā)布R軟件包（MetaboAnalystR）以及相應(yīng)的R 命令的歷史面板以實(shí)現(xiàn)更透明及可重復(fù)的分析；

·擴(kuò)大了代謝組和代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)，從而通過(guò)功能富集分析實(shí)現(xiàn)代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)解釋；

·增加了一個(gè)基于MUMICHOHG算法、利用非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)通路活性預(yù)測(cè)的新模塊；

·一個(gè)支持代謝組學(xué)生物標(biāo)志物meta分析的新模塊； 

·一個(gè)支持通過(guò)基于知識(shí)的網(wǎng)絡(luò)分析和可視化實(shí)現(xiàn)多組學(xué)數(shù)據(jù)整合的新模塊；

·其他重要的更新，包括為了實(shí)現(xiàn)MetaboAnalyst的便捷下載和本地安裝的Docker image；提供了直接鏈接，實(shí)現(xiàn)與核磁共振（NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）光譜分析相關(guān)的多個(gè)在線工具的關(guān)聯(lián)。

MetaboAnalyst 4.0可在http://metabo.st.ca免費(fèi)獲得。

1 MetaboAnalyst 4.0框架概述

MetaboAnalyst用戶界面的升級(jí)，既提供了更現(xiàn)代的“外觀和感覺(jué)”，也保留了相同的易于操作的模塊化分析途徑。所有功能現(xiàn)在被分成4類12個(gè)模塊：(一)探索性統(tǒng)計(jì)分析，(二)功能分析，(三)數(shù)據(jù)整合和系統(tǒng)生物學(xué)，(四)數(shù)據(jù)處理和通用功能(圖1)。

圖1

探索性統(tǒng)計(jì)分析類模塊 (一般統(tǒng)計(jì)、生物標(biāo)志物分析、雙因素/時(shí)間序列分析和功效分析)可以接受來(lái)自靶向或非靶向的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)。功能分析類模塊除了用于代謝物組富集分析和靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的通路分析兩個(gè)現(xiàn)有模塊外，還包括一個(gè)根據(jù)MS數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)通路活性的新模塊。數(shù)據(jù)集成和系統(tǒng)生物學(xué)類包括三個(gè)模塊（生物標(biāo)志物meta分析、聯(lián)合通路分析和network瀏覽器）。最后，數(shù)據(jù)處理和通用功能類模塊包含通用數(shù)據(jù)處理工具，如化合物ID轉(zhuǎn)換,批處理效應(yīng)校正，以及與三個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的實(shí)用工具的關(guān)聯(lián)，包含支持NMR的Bayesil, 支持GC-MS的GC-AutoFit以及支持LC-MS的XCMS Online。

2 MetaboAnalystR以及改進(jìn)了的透明度/可重復(fù)性

MetaboAnalyst持續(xù)更新的潛在缺點(diǎn)是界面或默認(rèn)參數(shù)設(shè)置的微小變化，可能導(dǎo)致長(zhǎng)期的可重復(fù)性問(wèn)題。解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)可能方法是在不同的時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)建工具的多個(gè)快照，但相關(guān)的維護(hù)成本卻令人望而卻步。另一種方法是在整個(gè)分析過(guò)程中提高M(jìn)etaboAnalyst的透明度。因?yàn)镸etaboAnalyst的多數(shù)分析都基于R軟件的功能，所以在操作時(shí)使用嵌入可選參數(shù)的R命令會(huì)更有效。而且，MetaboAnalyst的許多高級(jí)用戶已經(jīng)請(qǐng)求訪問(wèn)基礎(chǔ)R代碼，以便開發(fā)個(gè)性化定制的數(shù)據(jù)分析或執(zhí)行批量數(shù)據(jù)處理。

為了適應(yīng)這些需求（更好地支持透明性、靈活性和批量分析），我們開發(fā)了MetaboAnalystR軟件包。R軟件包的使用可以保證用戶能夠?qū)崟r(shí)“查看”并保存MetaboAnalyst正在運(yùn)行的R代碼，從而使得在本地使用該代碼來(lái)再現(xiàn)分析工作成為可能。MetaboAnalystR和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器之間的R代碼也已修改，可以確保兩者之間完全互換，并在跨平臺(tái)操作時(shí)也保證相同功能。在數(shù)據(jù)分析的每一步，R命令會(huì)顯示在頁(yè)面右側(cè)“R命令歷史”的側(cè)欄中，每個(gè)命令會(huì)根據(jù)執(zhí)行順序出現(xiàn)（圖2A）。MetaboAnalyst還將整個(gè)R命令歷史作為可執(zhí)行R腳本存儲(chǔ)，以便在完成每個(gè)模塊后下載這個(gè)包含用戶選擇的所有參數(shù)和操作的腳本。這種形式（R腳本）可以很容易在網(wǎng)絡(luò)上共享和復(fù)制，或者使用MetaboAnalystR包實(shí)現(xiàn)本地復(fù)制。

對(duì)于MetaboAnalyst的任何更新，都存在關(guān)于早期服務(wù)器執(zhí)行的數(shù)據(jù)分析的可重復(fù)性的問(wèn)題。例如，由于基礎(chǔ)代謝物組庫(kù)的更新，輸入相同的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果的排列順序和P值將會(huì)改變。為了幫助解決這個(gè)問(wèn)題，MetaboAnalyst（3.0版）仍可考慮維持使用（http://old.metabo.st.ca），只要有足夠訪問(wèn)和使用。

3 MetaboAnalyst的知識(shí)庫(kù)更新

為了解決缺少更新的解釋導(dǎo)致分析質(zhì)量下降等潛在問(wèn)題，我們更新了用于代謝物名稱映射的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)、用于代謝通路分析的通路庫(kù)和用于功能富集分析的代謝物組信息。更新細(xì)節(jié)如下。

化合物數(shù)據(jù)庫(kù) 功能分析之前，MetaboAnalyst執(zhí)行內(nèi)部映射，將常見化合物的名稱映射到各種數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符，包括KEGG、HMDB、ChEBI、METLIN和PubChem。這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)用HMDB版本4.0進(jìn)行了更新，包括HMDB標(biāo)識(shí)符的更新以及關(guān)聯(lián)其他數(shù)據(jù)庫(kù)的鏈接。因此，MetaboAnalyst的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)擴(kuò)展到約19 000個(gè)化合物，并帶有與下游功能分析相關(guān)的詳細(xì)解釋，代表了HMDB化合物（約114 100）的核心子集。

代謝物組和代謝通路庫(kù) MetaboAnalyst的代謝物組主要由其MSEA模塊使用。六個(gè)現(xiàn)有的和一個(gè)新的代謝產(chǎn)物組庫(kù)，均是基于HMDB 4.0版本更新/創(chuàng)建。更新的代謝產(chǎn)物組庫(kù)包括血液疾病組（330種疾病增加至344種），腦脊液（108種疾病增加至166種）和尿液（108種疾病增加至166種）相關(guān)疾病，以及基于部位分布的代謝物組（從57個(gè)器官、生物流體和組織增加至73），基于通路的代謝物組（從80個(gè)代謝通路增加至147個(gè)），單核苷酸多態(tài)性（SNPs）-相關(guān)的代謝物組（從4501個(gè)SNP增加至4598個(gè)）和一個(gè)新的藥物相關(guān)通路的代謝物組庫(kù)（461個(gè)通路）。這些代謝物組僅來(lái)自于人類數(shù)據(jù)，因此目前正在更新通路分析模塊，以支持來(lái)自SMPDB的大量通路的交互式可視化分析。

4 新模塊#1：MS峰到通路

高通量分析和基于非靶向或MS的宏觀代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的功能解釋仍然是當(dāng)前代謝組學(xué)研究的主要瓶頸。傳統(tǒng)的基于MS的處理通常包括峰值識(shí)別、光譜反卷積和峰值標(biāo)注。解決這些問(wèn)題的方法通常會(huì)產(chǎn)生一個(gè)“干凈”的MS峰列表，然后通過(guò)搜索各種光譜或化合物數(shù)據(jù)庫(kù)手動(dòng)完成峰值標(biāo)注。但這一過(guò)程通常會(huì)產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性，而高分辨率MS儀正不斷地用來(lái)減少這些假陽(yáng)性。在計(jì)算上，一種有前景的思路是將分析單元從單個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到單個(gè)通路（或任何一組功能相關(guān)的化合物，它們共同產(chǎn)生獨(dú)特的光譜足跡）——類似于廣泛使用的基因組富集分析或GSEA。Mummichog算法是這個(gè)思路的簡(jiǎn)潔、有效的實(shí)現(xiàn)方法，它使得利用高分辨率MS峰直接預(yù)測(cè)通路活性成為可能，而不需要預(yù)先執(zhí)行精確的峰值標(biāo)注。我們?cè)贛etaboAnalyst中添加了新模塊（MS Peaks to Pathways），通過(guò)用戶友好的界面支持基于Mummichog算法的MS峰值分析。在R中實(shí)現(xiàn)了Mummichog（1.0.10版本）算法，從而與MetaboAnalyst的工作流程和前述的可重復(fù)性策略保持一致。該模塊的知識(shí)庫(kù)包括5個(gè)基因組規(guī)模的代謝模型以及21個(gè)生物體的擴(kuò)展庫(kù)。在未來(lái)幾個(gè)月內(nèi)，SMPDB通路還將包含其他模式生物。雖然在Mummichog算法中，化合物的識(shí)別通常不被重視，但是匹配化合物的后處理分析對(duì)于下游的驗(yàn)證和解釋是至關(guān)重要的。為了滿足這些需求，我們實(shí)現(xiàn)了KEGG式的全局代謝網(wǎng)絡(luò)，允許用戶可視化整個(gè)峰匹配模式，并交互放大為特定的候選化合物，以檢查其所有匹配的同位素或加合物形式。

使用該模塊，用戶必須上傳一張包含3列——m/z特征、P值以及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（例如t值或倍數(shù)變化值）的表格。如果還沒(méi)有計(jì)算出這些值，用戶可以將m/z峰值列表文件或峰值表上傳到MetaboAnalyst的統(tǒng)計(jì)分析模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，再將這些結(jié)果上傳到“MS Peaks to Pathways”模塊。同時(shí)，用戶需要指定它們的精確度、離子模式（正或負(fù)）和P值界值，以描繪豐富的m/z特征和背景。在數(shù)據(jù)上傳之后，用戶必須選擇一個(gè)有機(jī)體（庫(kù)）來(lái)執(zhí)行非靶向通路分析。

“MS Peaks to Pathways”模塊的輸出包括一個(gè)結(jié)果表，表內(nèi)包含用戶上傳數(shù)據(jù)中所富集的通路排序。該表包括匹配總數(shù)、原始P值（Fisher精確或超幾何測(cè)試）、EASE分?jǐn)?shù)和根據(jù)用戶數(shù)據(jù)使用Gamma分布建模的P值。用戶可以點(diǎn)擊“查看”鏈接查看每個(gè)通路的詳細(xì)情況，也可以下載包含用戶上傳的所有m/z特征的化合物的匹配信息的綜合表。重要的是，所有這些信息（通路、化合物和匹配峰）可以在KEGG全局代謝網(wǎng)絡(luò)（圖2b）內(nèi)直觀地進(jìn)行深入研究。該頁(yè)面由三個(gè)部分組成：（i）含有控制各種可視化特征的菜單的頂部工具欄，（ii）顯示通路分析結(jié)果的左側(cè)面板和（iii）用于代謝網(wǎng)絡(luò)交互式視覺(jué)探索的中心視圖。用戶可以滾動(dòng)鼠標(biāo)放大和縮小網(wǎng)絡(luò)視圖。點(diǎn)擊通路左側(cè)面板上的名稱可以突出其所在網(wǎng)絡(luò)的所有化合物。雙擊代謝物節(jié)點(diǎn)將顯示相應(yīng)化合物的所有匹配細(xì)節(jié)，如圖2B所示。當(dāng)前視圖可以作為便攜式網(wǎng)絡(luò)圖形（PNG）或可縮放矢量圖形（SVG）文件下載。

圖2

5 新模塊#2：生物標(biāo)志物的meta分析

生物標(biāo)志物識(shí)別仍然是代謝組學(xué)研究的重要領(lǐng)域。對(duì)于同一疾病進(jìn)行的不同代謝組學(xué)研究，生物標(biāo)志物的一致性和魯棒性仍有問(wèn)題。為了解決生物標(biāo)志物的驗(yàn)證和可重復(fù)性問(wèn)題，有研究人員在相似條件下收集的多個(gè)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集，這種方法可以減少研究偏倚，從而使生物標(biāo)志物更加可靠。這種做法通常被稱為生物標(biāo)志物的meta分析。如果執(zhí)行得當(dāng)，生物標(biāo)志物的meta分析能夠利用多個(gè)獨(dú)立研究的匯總效能，顯著地提高識(shí)別數(shù)據(jù)內(nèi)的真實(shí)情況的精度。然而，目前還沒(méi)有專門用于代謝組學(xué)生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)的meta分析工具。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們?cè)贛etaboAnalyst 4中增加了“生物標(biāo)志物meta分析”模塊，其目標(biāo)是將來(lái)自多個(gè)獨(dú)立代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)集進(jìn)行meta分析，以此識(shí)別更優(yōu)的生物標(biāo)志物。其主要步驟如下：

i. 在上傳數(shù)據(jù)之前，用戶應(yīng)整理所有數(shù)據(jù)集，以確保特征名稱(化合物ID、光譜存儲(chǔ)器或峰)以及所有研究中分類標(biāo)簽(僅兩組)的一致性；                

ii. 一旦數(shù)據(jù)被整理和上傳，用戶可以對(duì)每個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)集執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理、標(biāo)準(zhǔn)化和差分分析；              

iii. 一旦通過(guò)上述步驟(ii)處理了每個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)集，就可以使用以下幾種統(tǒng)計(jì)選項(xiàng)之一來(lái)執(zhí)行meta分析：(a)合并P值，(b)計(jì)數(shù)或(c)直接合并非常相似的數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)；             

iv. 在完成步驟iii之后，將得到一張包含所有重要特征的匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果的表格。用戶可以單擊查看不同數(shù)據(jù)集上任何特征的箱圖摘要；

v. 用戶可以在交互式Venn圖中直觀地分析meta分析結(jié)果，以查看數(shù)據(jù)集的所有可能組合之間的共同特征。圖2C中是例舉的一個(gè)例子。

6 新模塊#3：網(wǎng)絡(luò)瀏覽器

代謝組學(xué)正越來(lái)越多地與其他組學(xué)平臺(tái)一起用于研究復(fù)雜疾病以及獲得對(duì)微生物群落功能的認(rèn)識(shí)。然而，整合多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)并在系統(tǒng)層面解釋這些結(jié)果已經(jīng)成為一個(gè)重大挑戰(zhàn)。一種常用的策略是使用已經(jīng)為每個(gè)領(lǐng)域開發(fā)的工具和方法，分別分析每組組學(xué)數(shù)據(jù)，然后使用顯著特征（即代謝物、基因和蛋白質(zhì)）的單獨(dú)列表拼湊出“大畫面”。已知的基因、代謝物和疾病之間的關(guān)系可以輕易地展示為基于知識(shí)的網(wǎng)絡(luò)（network），加上對(duì)交互式網(wǎng)絡(luò)的可視化，將是解決當(dāng)前數(shù)據(jù)整合挑戰(zhàn)的重要策略。已經(jīng)開發(fā)出的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器模塊可以為用戶提供一個(gè)易于使用的界面，允許將他們的代謝物和/或基因（包括KEGG直系圖或KOs）映射到不同類型的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)上。然后，這種網(wǎng)絡(luò)的可視化可以用于獲得新的發(fā)現(xiàn)或幫助用戶發(fā)現(xiàn)新的假設(shè)。

網(wǎng)絡(luò)瀏覽器模塊是對(duì)MetaboAnalyst的聯(lián)合通路分析模塊的補(bǔ)充，它支持橫跨傳統(tǒng)通路的連接，并且能在全局視野下分析單個(gè)通路中不明顯的功能變化。網(wǎng)絡(luò)瀏覽器模塊目前支持五種類型生物網(wǎng)絡(luò)，包括KEGG全局代謝網(wǎng)絡(luò)、基因-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)、代謝物疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)、代謝物-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)和代謝物-基因-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)。最后四個(gè)網(wǎng)絡(luò)僅適用于人類研究。

用戶可以上傳代謝產(chǎn)物列表，基因列表，或兩者兼而有之。對(duì)于代謝物，MetaboAnalyst 4.0目前接受化合物名稱、HMDB ID或KEGG化合物ID作為代謝物標(biāo)識(shí)符。對(duì)于基因，Entrez IDs, ENSEMBL IDs，官方基因符號(hào)或KEGG直系同源物目前得到支持。然后，使用MetaboAnalyst內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)映射上傳的代謝產(chǎn)物和基因列表。隨后，用戶可以選擇五個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的任一個(gè)開始可視化地探索他們的數(shù)據(jù)，還可以執(zhí)行功能富集分析，然后突出那些感興趣的代謝物或基因涉及的功能網(wǎng)絡(luò)。圖2D顯示了MetaboAnalyst的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器模塊的一個(gè)輸出示例。每個(gè)生成的網(wǎng)絡(luò)可導(dǎo)出為SVG或PNG圖片，用于發(fā)布。交互式網(wǎng)絡(luò)探索、功能富集分析和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅募蓪橛脩籼峁└嗟男畔?，促進(jìn)相關(guān)研究。

7 其他更新

基于過(guò)去三年積累的用戶建議，還有些小的更新。例如，在生物標(biāo)志物分析模塊中，許多用戶希望選擇提供與已選生物標(biāo)志物信息互補(bǔ)的特征。因此，我們使用k-means分析得出的聚類成員添加特征相似性信息，以支持特征選擇。另外，我們還添加了兩種常用的偏最小二乘（PLS）方法，用于改進(jìn)數(shù)據(jù)解釋以及實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)健的統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于雙因素方差分析，我們也實(shí)現(xiàn)了對(duì)I型和III型方差分析的支持，以及對(duì)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的附加分析選項(xiàng)。我們還嘗試通過(guò)添加“光譜分析”功能來(lái)為用戶提供易于使用、可免費(fèi)用于光譜處理和注釋的網(wǎng)絡(luò)工具，包含支持NMR的Bayesil, 支持GC-MS的GC-AutoFit以及支持LC-MS的XCMS Online。

8 安裝使用

MetaboAnalyst 4.0的使用是基于Prime-Faces（v6.1）組件庫(kù)（http://primefaces.org/）和R軟件（版本3.4.3）實(shí)現(xiàn)的。利用sigma.jsJavaScript庫(kù)（http://sigmajs.org）實(shí)現(xiàn)交互式網(wǎng)絡(luò)可視化。整個(gè)系統(tǒng)架設(shè)在谷歌云服務(wù)器上，擁有32GB的RAM和八個(gè)虛擬CPU，每個(gè)為2.6 GHz。對(duì)于希望在本地使用MetaboAnalyst 4.0的用戶，我們提供了將MetaboAnalyst下載為war文件或Docker image的選項(xiàng)。在網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的“資源”頁(yè)，我們提供了下載和本地安裝的詳細(xì)說(shuō)明。在GitHub（http://GITHUB.COM/XIALAB/MetaboAnalystR）出可以下載MetaboAnalystR包。

9 與其他工具的比較

XCMS Online、Workflow4Metabolomics、Galaxy-M和Metabox等工具和MetaboAnalyst 4.0及其以前版本之間的詳細(xì)比較如表1所示。

表1

基于該表，MetaboAnalyst為統(tǒng)計(jì)分析、功能解釋以及與其他組學(xué)數(shù)據(jù)的整合提供了最全面的支持。很顯然，MetaboAnalyst支持實(shí)時(shí)交互數(shù)據(jù)分析的方式，目前沒(méi)有其他工具能夠?qū)崿F(xiàn)。雖然MetaboAnalyst在其原始頻譜處理和注釋的內(nèi)置支持方面有所缺陷，但新的“頻譜分析”特性有助于解決這一問(wèn)題。原始LC-MS光譜處理和分析一直是XCMS Online、Galaxy-M和Workflow4Metabolomics的主要優(yōu)勢(shì)，而且這些工具仍然是LC-MS數(shù)據(jù)分析的必用工具?？傮w而言，MetaboAnalyst的主要優(yōu)勢(shì)在于其下游數(shù)據(jù)分析，就像Metabox一樣。事實(shí)上，MetaBox的設(shè)計(jì)類似于MetaboAnalyst，它主要接受經(jīng)過(guò)預(yù)處理的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，用于各種統(tǒng)計(jì)計(jì)算、功能分析和基于網(wǎng)絡(luò)的整合。然而，Metabox當(dāng)前必須本地安裝后才能使用。