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編譯：ye00ye，編輯：十九、江舜堯。

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采樣地點和樣本收集

草和土壤樣本于2018年5月從大墨爾本(圖S1)的40個城市公園采集。期間天氣多晴朗、無降雨，溫度在12.6℃至19.5℃之間。沒有一個采樣公園受到再生水灌溉等任何潛在點源污染。每個公園，在相距至少100米的距離處收集三個土壤樣本，并為每個樣本混合從表面5厘米土壤中提取的九個土壤芯。用消毒剪刀從植物的地上部分采集草樣。每種(即植物和土壤)各收集120個樣品。所有樣品都被轉移到無菌塑料袋中，收集后立即冰藏運送至實驗室。部分土壤樣品經(jīng)輕輕壓碎后通過2mm的篩子進行土壤性質分析，其余樣品在提取DNA之前儲存在-80℃。

土壤特性

依據(jù)澳大利亞土壤化學方法進行所有土壤的特性分析。測量土壤電導率、pH、總碳、總氮、重金屬Cu和Fe的濃度以及土壤陽離子交換容量(CEC)。

人類活動參數(shù)數(shù)據(jù)的收集

人類活動參數(shù)從澳大利亞統(tǒng)計局網(wǎng)站上收集。這些參數(shù)分為兩類：居民因素包括人口密度和平均家庭總收入；工業(yè)因素包括企業(yè)總數(shù)、制造業(yè)數(shù)量、電力、天然氣、水和廢物服務數(shù)量。

DNA提取

利用試劑盒根據(jù)說明書進行DNA的提取。提取到的DNA濃度和質量通過使用NanoDrop ND2000c spectrophotometer分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行檢查。DNA儲存于-20℃。

高通量qPCR

高通量qPCR(HT-qPCR)以確定ARGs的多樣性(即檢測到的靶基因的數(shù)量)和豐度。ARGs和MGEs的用相對豐度法測量。

16S rRNA基因的qPCR分析

樣品中細菌16S rRNA DNA的qPCR分析在Bio-Rad CFX384 realtime-PCR檢測系統(tǒng)上進行。

Illumina 測序和數(shù)據(jù)處理

Illumina Miseq平臺，使用引物對341F:CCTAGGGRBGCASCAG和806R:GGACTACYVGGGTACTAT進行測序。使用QIIME平臺進行進一步的數(shù)據(jù)處理。使用UCLUST基于97%的相似性進行OTU聚類。嵌合序列、葉綠體和線粒體OTU以及單個OUT被棄去。根據(jù)GreenBanks 16S rRNA數(shù)據(jù)庫對OTU進行注釋。

統(tǒng)計分析

在Excel中進行原始數(shù)據(jù)的簡單處理。所有的統(tǒng)計分析以P < 0.05作為顯著水平。使用R “vegan” 包進行PCoA分析，評估抗藥性和微生物群落的概況。用普通最小二乘法(OLS)回歸模型確定MGEs、cint1基因和ARGs豐度之間的關系，使用r中的“ggplot 2”包進行可視化。人類活動因素和耐藥基因組之間的相關性通過Spearman的等級相關性使用SPSS25進行研究。

隨機森林建模與結構方程模型構建

使用R中構建隨機森林模型，來確定城市綠地抗生素耐藥性的主要預測因子。在隨機森林模型中，MGEs、土壤性質、人類活動因素、細菌豐度以及樣本中十個最豐富門的相對豐度作為ARGs豐度的預測因子。方差（MSG）的增加被用來確定ARGs豐度驅動因素的重要性。計算每棵樹的均方誤差，并在5000棵樹上取平均值。

作者建立了結構方程模型(SEMs)來測試土壤性質、工業(yè)因素、細菌豐度和多樣性以及MGEs和ARGs豐度之間的偶然關系。基于已知的ARGs驅動因素之間的效應和關系，建立一個先驗模型(圖S2)。使用SPSS 25確定Z-scores標準化后數(shù)據(jù)之間的成對相關性。協(xié)方差矩陣被導入AMOS 25用于SEM構建。SEMs總體擬合優(yōu)度由多重擬合優(yōu)度標準決定：χ2檢驗P > 0.05，擬合優(yōu)度指數(shù)(GFI) > 0.90，近似均方根誤差(RMSEA) < 0.10。通過將直接和間接效應相加，計算出每個驅動因素對ARGs豐度的標準化總效應。

城市綠地ARGs表征

利用HT-qPCR技術，在所有草葉層和土壤樣品中分別檢測到217個和218個獨特的ARGs和MGEs。土壤中ARGs的歸一化相對豐度顯著高于草葉層(配對t檢驗，P < 0.05)(圖1A)?；?/span>Bray-Curtis距離的PCoA(圖1B)顯示，草葉層中的ARGs聚類在一起，并沿PCo1和PCo2與土壤中的ARGs分離，這分別解釋了ARGs方差的13.30%和17.50%。這一結果表明，土壤中ARGs的總體分布不同于草地葉層中ARGs的總體分布，Adnois試驗結果證實了這一點(P < 0.01)。

檢測到的ARGs包括所有三種主要的抗生素耐藥機制，其中外排泵是主要的耐藥機制(圖2A)。根據(jù)基因產(chǎn)生耐藥性的抗生素類別，作者將ARGs分為八種類型，即氨基糖苷類、β-內酰胺類、磺胺類、氯霉素和安芬尼可(FCA)、大環(huán)內酯-林可酰胺-鏈菌素B (MLSB)、多藥、四環(huán)素和萬古霉素耐藥基因。多藥耐藥基因是最豐富的ARGs類型，分別占草葉層和土壤總豐度的43.91%和52.22%(圖2B)。第二種和第三種最豐富的ARGs在草葉層中是四環(huán)素(24.58%)和氨基糖苷類(11.90%)，而土壤中則是MLSB (18.50%)和β內酰胺酶(12.30%)(圖2B)。

檢測到的8個MGEs，包括6個轉座子轉座酶基因、1類整合子整合酶基因(intI1)和臨床1類整合子整合酶基因(cintI1)。由于MGEs在通過水平基因轉移(HGT)傳播ARGs中的重要作用，使用普通最小二乘法(OLS)回歸模型確定了ARGs和MGEs豐度之間的關系。在草葉層(R= 0.568，P < 0.01)和土壤(R= 0.673，P < 0.01)中觀察到ARGs和MEGs的豐度呈正線性關系(圖3)。除了總MGEs的豐度之外，在草葉層樣品(R= 0.345，P < 0.01)和土壤樣品(R= 0.664，P < 0.01)中，ARGs的豐度和臨床1類整合子整合酶基因(intI1)之間的關系也保持不變(圖3)。

圖1. 基于草葉層和土壤樣品中ARGs的相對豐度確定抗性基因的分布。（A）樣品中檢測到的ARGs的相對豐度的箱線圖 。（B）基于Bray-Curtis距離的主坐標分析(PCoA)，顯示樣本中ARGs的分布規(guī)律。

圖2.（A）根據(jù)抗性機制對在草葉層和土壤中檢測到的ARGs進行分類。（B）ARGs產(chǎn)生耐藥性的抗生素。

圖3. 利用普通最小二乘法(OLS)回歸分析了草葉層和土壤樣品中ARGs相對豐度與總MGEs和臨床1類整合酶基因(cintl1)的關系

城市綠地微生物群落特征

在草葉層中，OTUs被分為35門115綱。變形菌是最豐富的門，占細菌總序列的77.14%(圖S3)。第二和第三豐富的門是擬桿菌(18.04%)和放線菌(2.96%)(圖S3)。土壤方面，OTUs被分為45門141綱。放線菌(41.58%)和變形菌(30.64%)是前兩個優(yōu)勢門，其次是酸菌(10.94%)(圖S3)。土壤中細菌α多樣性顯著高于草葉層(配對t檢驗，P < 0.001)，這一點已被Chao1和Shannon指數(shù)(圖4A)所證實?；贐ray-Curtis距離的PCoA揭示了草葉和土壤之間細菌分布的顯著差異(圖4B)。土壤樣品很好地聚類在一起，并沿PCo1軸與草葉層樣品分離開，這解釋了總方差的11.03%。

圖4.（A）細菌alpha多樣性在草葉層和土壤樣本中，***表明P < 0.001（配對t檢驗）。(B)基于Bray-Curtis距離的主坐標分析(PCoA)，顯示了在草葉層和土壤樣本中細菌群落(beta多樣性)的分布模式。

圖S3. 草樣層和土壤中細菌群落在門級水平的組成

城市綠地中的核心耐藥基因和核心微生物群

在草葉層中，超過80%的樣品共同享有33個基因，占抗性基因總豐度的84.25%(圖5)。這些分布廣泛的基因被定義為草葉層核心耐藥基因。這類基因主要由多藥和四環(huán)素抗性基因和MGEs相關的基因組成(圖S4)。在土壤樣品，沒有鑒定出核心耐藥基因，因為只有三個基因(cintI1、oprJ和oleC)被超過80%的樣品共享(只占ARGs總豐度的< 25%)。城市綠地中的核心微生物群也已被鑒定。對于草葉層，13.59%的屬在> 80%的樣品中共享，占總序列的97.78%（圖S5）。對于土壤，24.90%的屬在> 80%的樣品，占總序列的96.22%(圖S5)。

圖5.ARGs在草葉層和土壤中的分布頻率

圖S4.草樣中核心抗性基因的分類分布

圖S5.草樣和泥樣微生物群落在屬水平上的頻率分布

城市綠地中人類活動因素與耐藥基因組的相關性

總的來說，工業(yè)因素與土壤耐藥基因的相關性比與草葉層耐藥基因的相關性更強。無論是在草葉層還是土壤中，居住條件與耐藥抗性均無顯著正相關。結果表明，工業(yè)因素與耐藥基因呈顯著正相關。例如，在草葉層中，電、氣、水和廢物服務的數(shù)量以及制造業(yè)的數(shù)量與耐藥基因相關性顯著(P < 0.05)，分別與總ARGs和FCA抗性基因的豐度呈顯著正相關(表1)。對于土壤，所有工業(yè)因素與總ARGs(P < 0.01)和氨基糖苷類耐藥基因(P < 0.05)的豐度呈顯著正相關。此外，制造業(yè)的數(shù)量和電力、天然氣、水和垃圾回收設施的數(shù)量顯著(P < 0.05)，并且與各種類別的ARGs(包括氨基糖苷類、β-內酰胺類、多藥和萬古霉素抗性基因)的豐度呈正相關。

城市綠地耐藥基因的多重驅動因素

結果表明，多種因素可能影響城市綠地的耐藥基因分布。因此，作者使用隨機森林模型來識別兩種樣本類型中ARGs豐度的主要預測因子。MGEs和細菌豐度是草葉層ARGs豐度的兩個最重要的驅動因素(圖S6A)。MGEs的豐度是土壤中ARGs豐度的最重要驅動力，而人類活動因素對ARGs豐度有不可忽視的貢獻(圖S6B)。

結構方程模型（SEMs）被用來進一步探索多因素與ARGs豐度之間的偶然關系。SEMs分別解釋了草葉層和土壤中ARGs含量的28%和63%的差異(圖6)。在草葉層和土壤中，MGEs的豐度是形成ARGs分布的最主要的積極因素(圖6)，這與隨機森林分析一致(圖S6)。SEMs最重要的發(fā)現(xiàn)是，即使在考慮多個因素的情況下，工業(yè)因素對草葉層(λ = 0.14，P < 0.01)和土壤(λ = 0.15，P < 0.01)中ARGs的豐度也有直接的積極影響，這與Spearman’s ranked相關性檢驗一致。

圖6. 結構方程模型(SEMs)顯示了多種因素對草葉層(A)和土壤(B)中ARGs豐度的直接和間接影響。箭頭旁邊的數(shù)字是標準化的路徑系數(shù)。箭頭的寬度與路徑系數(shù)的強度成正比。R²表示由模型解釋的ARG豐度方差的比例。顯著性水平分別為**P < 0.01和***P < 0.001。標準化效應由結構方程模型導出。

圖S6. 隨機森林預測值的重要性，通過城市綠地(A)草葉層和(B)土壤樣品中ARGs相對豐度的均方誤差增加百分比來衡量。

城市綠地抗生素耐藥基因

在城市公園的草坪和土壤中檢測到多種ARGs，表明與公眾日常生活密切相關的城市綠地是抗生素耐藥性的研究熱點。在草葉層中發(fā)現(xiàn)了核心耐藥基因，但在土壤中沒有發(fā)現(xiàn)(圖5)。有兩個潛在的原因：(1)據(jù)報道，細菌系統(tǒng)發(fā)育是包括土壤、飲用水和蔬菜在內的不同環(huán)境中耐藥基因豐度的主要決定因素。SEMs證實，對于兩種樣品類型，細菌多樣性通過對MGEs豐度的直接影響間接影響ARGs分布(圖6)。與土壤相比，草葉層中細菌群落的多樣性較低，這可能是土壤和草葉層之間ARGs差異的主要原因(圖4A)。(2)與土壤微生物群相比，植物微生物群更容易受到周圍非生物條件如水分、溫度和輻射波動的影響，這可能是導致細菌耐藥性發(fā)展的壓力因素。

MGEs介導的水平基因轉移(HGT)可能促進ARGs在不同系統(tǒng)發(fā)育中的傳播。MGEs是攜帶ARGs的有效載體，例如，細菌可以使用1類整合子來儲存和表達外源抗性基因。在本研究中，城市公園的草坪和土壤中始終檢測到高多樣性的MGEs。我們的SEMs和隨機森林模型(圖S6)表明，MGEs是決定草葉層和土壤中ARGs豐度的最重要因素，這與OLS回歸模型一致，即ARGs豐度與MGEs豐度顯著相關(圖3)。這與之前的觀察一致，即葉層和根際是HGT的關鍵區(qū)域，因為在這些區(qū)域細菌代謝率和流動性高，細胞聚集和生物膜形成的可能性高。這些結果表明，HGT在城市綠地中傳播ARGs的潛力不容忽視。

工業(yè)分布決定了ARGs的分布

本研究在無點源污染的城市公園進行，采樣點之間的溫度和降雨量等環(huán)境因素差異極小。因此，檢測到的各種ARGs可能受到人為影響的影響。值得注意的是，在草葉層和土壤中(圖3)均檢測到ARGs和cintI1基因的豐度之間的強相關性，后者被認為是人類活動影響的標志。居住因素(人口密度和中等當量家庭總收入)與草葉層或土壤中ARGs豐度之間沒有正相關性。這些發(fā)現(xiàn)與朱等人最近的一項研究一致，該研究表明人口或國內生產(chǎn)總值不是抗生素耐藥性分布的敏感指標。然而，作者觀察到工業(yè)因素在很大程度上導致了城市綠地中ARGs的出現(xiàn)。SEM結果表明，工業(yè)因素對草和土壤中ARGs含量有直接和積極的影響。工業(yè)因素，特別是制造業(yè)和電力、天然氣、水和廢物服務的數(shù)量與氨基糖苷類、β內酰胺酶、多藥耐藥基因和萬古霉素耐藥基因的豐度之間的顯著相關性表明，工業(yè)污染可能是城市綠地中這些類型ARGs的重要來源。

居住因素和工業(yè)因素對城市綠地耐藥基因影響差異的一個潛在解釋可能是城市生活垃圾和工業(yè)廢物在廢物處理過程中化學成分的差異。已經(jīng)證明，與城市垃圾相比，工業(yè)廢物的特點是金屬濃度高。由于ARGs和某些金屬抗性基因的潛在共同選擇過程，金屬污染通常與耐藥基因相關聯(lián)。在本研究中，所研究的城市公園都沒有直接的污水污染。因此，大氣中工業(yè)污染物的沉積，而不是工業(yè)廢水的污染，更有可能是工業(yè)分布對城市綠地ARGs分布影響占主導地位的原因之一。

總之，本研究提供了城市綠地ARGs的綜合概況。結果表明，無點源污染的城市綠地是多種ARGs的潛在儲存庫。在草葉層中觀察到核心耐藥群體，但在土壤微生物群中沒有觀察到。我們發(fā)現(xiàn)工業(yè)因素是形成城市綠地耐藥基因分布的主要驅動因素，也是導致ARGs水平升高的原因。這些結果拓展了我們對與城市居民日常生活密切相關的一般城市環(huán)境中ARGs分布模式的認識，對管理與環(huán)境ARGs向人類病原體傳播相關潛在風險具有指導意義。

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