編譯：木子，編輯：小菌菌、江舜堯。
原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。
Ⅰ型糖尿病（T1DM），又名胰島素依賴型糖尿病，在體內(nèi)胰島素絕對缺乏的情況下，會引起血糖水平持續(xù)升高，出現(xiàn)糖尿病，進而會導致一系列并發(fā)癥甚至死亡。隨著Ⅰ型糖尿?。?/span>T1DM）患者的逐年增加，糖尿病已成為一種全球最重要的公共衛(wèi)生問題。近年來腸道菌群與T1DM的發(fā)生和發(fā)展密切相關。本研究通過腹腔注射75mg/ kg鏈脲佐菌素來構建SD大鼠T1DM模型，收集糞便樣本并提取DNA，構建16S rRNA微生物基因克隆文庫，最后進行高通量測序和生物信息學分析。
結果表明，T1DM大鼠中，與感染和炎癥相關的一些致病菌的含量上調(diào)，如Ruminococcaceae, Shigella, Enterococcus,Streptococcus, Rothia, Alistipes等，而一些有益菌的含量減少，如Lactobacillus, Faecalitalea, Butyricicoccus 和 Allobaculum等。其中，Butyricicoccus 和Allobaculum能通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸來保護腸屏障功能。這項研究表明，腸道菌群失衡引起的腸道炎癥和短鏈脂肪酸（SCFA）的減少對于T1DM的發(fā)病機理至關重要。
論文ID
原名：Investigation of gut microbiome changes in type1 diabetic mellitus rats based on high-throughput
譯名：Ⅰ型糖尿病大鼠腸道微生物組變化研究
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
IF：3.743
發(fā)表時間：2020年01月
通訊作者：王停、趙保勝
作者單位：北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心
實驗設計
結果
1. 一般指標
如表1所示，與對照組相比，T1DM大鼠的空腹血糖顯著增加（p <0.01），體重顯著下降（p <0.01），食物和水的攝入量同時顯著增加，表明T1DM組大鼠出現(xiàn)典型的糖尿病癥狀。
2. 胰腺的組織病理學檢查
如圖1所示，對照組大鼠胰腺組織病理學檢查顯示，外分泌腺泡和內(nèi)分泌細胞形態(tài)正常，胰島細胞排列不規(guī)則，數(shù)量和形態(tài)均正常，未見異常病理改變。而在T1DM大鼠的胰腺病理學檢查中，胰島數(shù)目減少，剩余的胰島中胰島實質(zhì)細胞顯示出輕度或中度增生，與對照組相比，T1DM大鼠的胰島損傷嚴重，胰島數(shù)目減少，胰島細胞明顯增生，提示T1DM大鼠胰島損傷與T1DM的典型病理變化是一致的。
3. 腸道菌群分析
Simpson和Shannon指數(shù)用來反映樣本中菌群的多樣性，Chao和ACE指數(shù)用來反映菌群的豐富度，Coverage指數(shù)用來反映樣本的檢測深度。如表2所示，兩組樣品的覆蓋指數(shù)均大于99.9％，表明檢測到樣品中所有腸道菌群的序列。 Alpha多樣性分析結果表明，與對照組相比，T1DM大鼠腸道菌群多樣性明顯增加，豐富度增加，這與腸道菌群多樣性增加與疾病相關的報道一致。
采用主成分分析法（PCA），我們對對照組和T1DM組腸道微生物組的差異進行分析，結果如圖2A所示，兩組之間的差異顯著，表明成功建立了T1DM模型。樣品的和弦圖，熱圖和分層聚類分析結果直接表明，兩組之間的腸道微生物組組成不同（圖2B，2C，2D）。這些結果初步表明，對照組和T1DM大鼠之間腸道微生物組的組成存在顯著差異。
為了進一步探討兩組之間腸道菌群結構的差異，我們分析了它們的門類和綱水平特征。除了菌群豐度低（<1％）外，我們發(fā)現(xiàn)兩組大鼠的腸道菌群基本相同，但不同菌群的菌落存在差異，這使得優(yōu)勢菌和菌群的整體結構成為可能。兩組之間的微生物群顯著不同，這可能是兩組大鼠表型不同的重要原因。
具體而言，在門水平上，對照組和T1DM組大鼠的優(yōu)勢門系是Firmicutes 和 Bacteroidetes，在對照組中，其豐度分別為58.5％和38％，在T1DM組中，分別為61.3％和32.6％，對照組與T1DM組之間差異較小。值得注意的是，如圖3A所示，兩組之間Actinobacteria的豐度差異很大，在對照組中，放線菌的豐度為0.323％，在T1DM大鼠中為2.2％。
在綱水平上，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在明顯差異，并且豐度發(fā)生了很大變化。 Bacilli（45.1％）是對照組大鼠中的第一優(yōu)勢綱類，其次是Bacteroidia（38％）和Clostridia（12.6％），而在T1DM大鼠中，Bacteroidia（32.6％），Clostridia（30.0％）和Bacilli（26.2％）為含量最高綱類。在T1DM大鼠中，Clostridia顯著上調(diào)，而Bacilli顯著下調(diào)。另外，如圖3B所示，T1DM大鼠中，Erysipelotrichia從0.8.5％顯著增加至5.09％。
從科水平來看，大多數(shù)變化顯著的細菌都集中在Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae,Lactobacillaceae 和Pretellaceae。 LEfSe多級物種層次樹直接反映了在門-科水平上兩組之間腸道菌群的差異（圖4）。
為了進一步闡明兩組之間的菌群差異，并獲得可能與T1DM的發(fā)展密切相關的菌屬，我們對兩組樣本的菌群從屬水平進行詳細分析。我們獲得了34個菌屬存在顯著性差異（p <0.05）（表3），其中13個在T1DM大鼠中呈現(xiàn)上調(diào)，而21個呈現(xiàn)下調(diào)。 LDA分析的結果表明，34個不同細菌屬的LDA值均大于2（LDA> 2.0，p <0.05）（圖5），表明其組間存在顯著差異。
值得注意的是，在34個細菌屬中，有3個是高豐度細菌，在正常和T1DM大鼠中，包括g_Lactobacillus, g_[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和g_Ruminococceae_UCG-014。前者在T1DM大鼠中明顯減少，而后兩者明顯增加，它們可能在T1DM的發(fā)展中起重要作用。此外，應注意，g_norank_c_Cyanobacteria, g_norank_o_NB1_n是T1DM大鼠的唯一屬，而g_Candidatus Arthromitus，g_Parvibacter和g_norank_f_Flavobacteriaceae是對照大鼠中唯一的屬，它們有可能被進一步研究作為診斷糖尿病的潛在指標。
T1DM。
4 腸道菌群、血糖和體重之間的相關性分析
為了進一步探討細菌屬與T1DM之間的密切關系，我們分析了腸道菌群，體重和血糖之間的相關性。結果表明存在很強的相關性，我們獲得了與體重和血糖顯著相關的細菌屬（p <0.05）（表4，圖6）。結果表明，g_Lactobacillus與血糖呈負相關，而g_Ruminococcaceae_UCG-014與血糖呈正相關，這與T1DM大鼠體內(nèi)的豐度變化一致。 g_Ruminococcaceae_UCG-014，g_norank_f_Erysipelotrichaceae，g_ Bifidobacterium,g__unclassified_f__Lachnospiraceae和g_norank_f_Lachnospiraceae與體重顯著相關，前三者與體重呈負相關，在T1DM大鼠中呈上升趨勢，而另兩個與體重呈正相關，在T1DM大鼠中呈下降趨勢，這與T1DM大鼠消瘦的特征相吻合。g_Lactobacillus andg_Ruminococcaceae_UCG-014具有顯著差異，并且對兩組之間的差異具有更大的貢獻。
5. 功能預測分析
16S的功能預測是通過PICRUSt軟件標準化操作分類單位（OTU）豐度表，從而消除16S標記基因?qū)ξ锓N基因組拷貝數(shù)的影響；然后通過Greengene ID獲取每個OTU的KEGG Ortholog（KO）信息；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫可計算出KO的豐度，可以得到KO，Pathway，EC信息，并且每個功能的豐度可以根據(jù)OTU的豐度來計算類別。如圖7所示，碳水化合物代謝，氨基酸代謝，能量代謝，核苷酸代謝，脂質(zhì)代謝和其他代謝途徑是兩組大鼠的主要途徑。結果表明，T1DM大鼠的腸道菌群參與了更多的代謝過程，更多的代謝途徑也在T1DM大鼠體內(nèi)被激活，這與T1DM的代謝疾病相一致。
討論
這項研究中，我們采用腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素的經(jīng)典方法來構建T1DM大鼠模型。血糖，體重等一般指標的變化以及胰腺組織病理學檢查都表明該模型已成功構建。在此基礎上，我們重點研究了T1DM大鼠腸道菌群的變化，以找出與T1DM密切相關的菌群，為研究調(diào)節(jié)腸道菌群的降血糖新藥提供實驗依據(jù)和參考。盡管相關研究很多，但突破性研究很少，可重復性差，與T1DM發(fā)病密切相關的細菌屬還需完全確認。在此基礎上，需要進行大量的基礎研究和反復驗證，通過研究和分析，我們得出了一些重要的新結論，可為后續(xù)研究奠定基礎。
就腸道菌群的總體結構而言，T1DM大鼠的腸道菌群的多樣性和豐富性顯著增加（p <0.05）。許多研究表明，腸道菌群多樣性的增加與疾病密切相關。在這項研究中，在對照和T1DM大鼠中，Firmicutes和Bacteroidetes均為優(yōu)勢菌。它們與肥胖和糖尿病密切相關。一些學者將Firmicutes定義為“脂肪細菌”，將Bacteroidetes定義為“ 健康細菌”。隨著Firmicutes/Bacteroidetes比例的增加，炎癥反應和體重指數(shù)也增加，并且產(chǎn)生胰島素耐受，最終導致糖尿病的發(fā)生。在本研究中，與對照組大鼠相比，T1DM大鼠腸道中的Firmicutes/Bacteroidetes的比例顯著增加，表明T1DM的發(fā)生可能與Firmicutes/Bacteroidetes的比例變化有關。
除上述三個屬外，T1MD大鼠中一些低豐度病原菌也明顯上調(diào)。它們主要與感染和炎癥有關，例如化膿性球菌的另一種常見細菌Streptococcus，屬于條件致病細菌，可能引起化膿性炎癥，毒素疾病和過敏性疾病等。Rothia是一種新發(fā)現(xiàn)的條件病原體，近年來不斷有報告稱其能引起感染。Alistipes被認為與結腸炎有關。此外，本研究中，產(chǎn)生乳酸的細菌也被上調(diào)，例如Faecalibaculum增加了10倍。 Faecalibaculum最初被發(fā)現(xiàn)在小鼠的糞便中產(chǎn)生乳酸，腸道中高水平的乳酸可能導致高乳酸血癥和糖尿病乳酸性酸中毒。在下降的菌群中，T1DM大鼠組中應注意Lactobacillus, Faecalitalea 和 Alobaculum。Lactobacillus是典型的有益細菌，發(fā)現(xiàn)表達ACE2的Lactobacillus對糖尿病小鼠具有治療作用，而Lactobacillus發(fā)酵劑可提高人的抗氧化能力并預防妊娠高血糖。其他研究也發(fā)現(xiàn)，植物Lactobacillus發(fā)酵可以改善人體免疫系統(tǒng)的功能，抗高血糖癥，并增強腸道蠕動的生理活性。在本研究中，Lactobacillus是兩組中最豐富的細菌，對照組的豐度為40.17％，T1DM組的豐度為22.63％。Lactobacillus與血糖之間存在顯著的負相關性，表明Lactobacillus可能在調(diào)節(jié)血糖方面發(fā)揮重要作用，其含量降低可能與糖尿病的發(fā)生有關。Faecalitalea屬于厚壁菌門，能發(fā)酵D -葡萄糖、蔗糖、D -甘露糖和棉子糖，代謝的主要最終產(chǎn)物是丁酸，丁酸能促進餐后胰島素分泌，改善糖尿病患者的胰島素反應。本研究中，T1DM大鼠腸道中Faecalitalea含量下降200多倍，提示其可能在糖尿病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，可能與胰島素分泌減少有關。Allobaculum被認為是小鼠的腸道內(nèi)的有益細菌，能抑制小鼠體重增加，發(fā)現(xiàn)服用低劑量抗生素的小鼠在四周體重明顯增加,其中一個重要原因是，低劑量的青霉素抑制Allobaculum；也有研究表明，Allobaculum是腸內(nèi)產(chǎn)生SCFAs的有益菌，可以直接或間接地起到抗炎作用，保護腸屏障功能，通過增加腸內(nèi)SCFAs的含量來調(diào)節(jié)人體的新陳代謝和免疫。尤其能預防和治療肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病。本研究中，Allobaculum在T1DM大鼠腸道中的含量減少了60多倍，提示其可能參與了糖尿病的發(fā)病過程，且T1DM組中Adlercreutzia和Butyricicoccus的減少也顯著，豐度變化超過10倍。Adlercreutzia被認為是一種有益腸道健康的細菌，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。Butyricicoccus對微生物生產(chǎn)SCFAs具有重要意義，增加了腸道中SCFAs的濃度，降低腸道中pH值，抑制了有害微生物的生長，改善了腸道菌群的結構和代謝能力。Dorea是人體腸道內(nèi)主要的產(chǎn)氣菌，它可以通過碳水化合物產(chǎn)生氣體，被認為是一種有益菌。T1DM大鼠Dorea含量的降低可能與疾病的嚴重程度有關。Candidatus Arthromitus 是對照組中唯一的細菌，也與免疫調(diào)節(jié)有關，在腸道先天免疫功能和獲得性免疫系統(tǒng)的形成中起關鍵作用。Candidatus Arthromitus的減少可能導致腸道免疫系統(tǒng)的失衡和一系列炎癥反應。然而，T1DM組未檢測到Candidatus Arthromitus，提示其消失可能與T1DM的發(fā)病有關。與SCFAs產(chǎn)生相關的細菌也有下調(diào)。Anaerofustis屬于厚壁菌門，可發(fā)酵碳水化合物和生產(chǎn)乙酸和丁酸，其含量的減少可能導致乙酸和丁酸合成的減少，這可能引起腸道炎癥反應的增加，從而導致脂質(zhì)和糖代謝異常，進而導致T1DM的發(fā)生。
此外，主要值得注意的是，我們在T1DM大鼠的腸道也發(fā)現(xiàn)了一些異常狀況，有益菌的增加，如Alloprevotella, Bifidobacterium,Anaerostipes，有害細菌的減少，如Helicobacter，這表明T1DM老鼠可能有自律效應來抵制胰島損傷、胰島素分泌不足和STZ所致的其他病理變化。其中，Alloprevotella是能夠產(chǎn)生SCFAs的物種，其豐度與代謝綜合征呈負相關；研究表明，Allobaculum可改善代謝綜合征，預防硫酸右旋糖酐引起的炎癥反應；Bifidobacterium是人腸道正常菌群中的重要益生菌，具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，口服雙歧桿菌可通過改善高脂飲食小鼠的炎癥反應，改善胰島素抵抗，降低血糖；研究表明，大多數(shù)雙歧桿菌能增強腸道內(nèi)源性胰島素刺激分泌肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的降血糖活性，從而抑制食欲，減輕體重，改善葡萄糖代謝。Anaerostipes是最重要的產(chǎn)丁酸細菌,丁酸是結腸上皮細胞首選的能量來源，其在維持人類結腸健康中扮演著重要的角色，補充丁酸的高脂肪飲食可以預防胰島素抵抗和肥胖的發(fā)展, 產(chǎn)丁酸細菌往往對T2DM病人有益。T1DM組大鼠腸道有益菌水平升高，提示T1DM組大鼠可能通過自我調(diào)節(jié)抵抗STZ引起的胰島損傷和胰島素分泌不足。幽門螺桿菌是一種主要的人畜共患病病原體，幽門螺桿菌是一種主要的人畜共患病病原體，可引起人和動物的胃腸炎、肝炎等傳染病，Helicobacter hepatica可引起免疫缺陷小鼠的炎癥性腸病。Helicobacter Bilis的自然感染與多種腸炎疾病有關，通過胃管接種CB-17scid/scid后可觀察到增殖性盲腸炎、盲腸黏膜增生、遠端結腸慢性炎癥。T1DM組大鼠腸道有害細菌的減少，提示TIDM大鼠可能具有自我調(diào)節(jié)作用。
結論
本研究表明，T1DM大鼠腸道菌群發(fā)生了顯著變化。T1DM大鼠感染炎癥相關病原菌豐度上調(diào)，如瘤Ruminococcaceae, Shigella, Enterococcus,Streptococcus, Rothia 和Alistipes，而有益菌和產(chǎn)SCFAs的細菌豐度降低，如Lactobacillus, Faecalitalea, Butyricicoccus和 Allobaculum等。這些結果表明，菌群失調(diào)與T1DM的發(fā)生顯著相關，腸道炎癥和SCFAs產(chǎn)生的減少導致的腸道菌群失衡可能在T1DM的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。
