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1. 引言：中心法則

生物學(xué)的中心法則描述了從DNA序列到蛋白一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列的信息流。首先，DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，接著RNA加工成mRNA，mRNA翻譯成蛋白序列。將mRNA翻譯成蛋白序列是關(guān)鍵步驟，由于起始位點(diǎn)和開放閱讀框ORF的鑒定是不確定的，因此遺傳密碼、編碼區(qū)的突變、翻譯起始位點(diǎn)的變化和翻譯后修飾，都可能導(dǎo)致蛋白序列的改變，這些因素的改變極可能導(dǎo)致翻譯的蛋白結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。

蛋白質(zhì)作為生物功能的體現(xiàn)者，決定了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活性，為細(xì)胞與和組織提供了信號機(jī)制，并且催化代謝過程中的化學(xué)反應(yīng)。此外，蛋白結(jié)構(gòu)決定其功能。由于蛋白質(zhì)可能是多種疾病的根源（如阿爾茨海默氏癥），因此也可以用它來治療疾病（如蛋白質(zhì)抗體能治療病毒和細(xì)菌感染）。在1950年，Sanger、Tuppy和Edman 首次分析了氨基酸序列。隨后，Holley研究組研究tRNA，Sanger致力于rRNA的研究，對RNA進(jìn)行了首次測序。接下來，DNA采用一系列方法（如加減法）進(jìn)行測序。隨著PCR技術(shù)和其它酶學(xué)的發(fā)展，DNA測序成為焦點(diǎn)，其總量和輸出量有很大提高。由于反轉(zhuǎn)錄酶使得RNA能反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行DNA測序，RNA測序也從中受益。然而，蛋白組測序技術(shù)處于滯后狀態(tài)。

由于測序技術(shù)成本降低，基因組和轉(zhuǎn)錄組測序被間接用于分析蛋白的一級結(jié)構(gòu)，但是不能獲取蛋白編碼基因的全長信息。例如，人類轉(zhuǎn)錄組具有116,156個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本不存在于已有的數(shù)據(jù)庫中。因?yàn)榛蚪M組裝的錯(cuò)誤率為0.1%，基因組組裝后不能完全捕獲蛋白編碼基因，例如，大腸桿菌的基因組大小為5 Mb，測序組裝的結(jié)果約有5000個(gè)錯(cuò)誤。單個(gè)堿基的插入或缺失是長讀長測序技術(shù)中的主要錯(cuò)誤，會產(chǎn)生移碼突變，使預(yù)測的蛋白一級結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的改變。人類基因組組裝時(shí)，高達(dá)580個(gè)（1.5%）的轉(zhuǎn)錄本具有堿基的插入和缺失，使得難以與人為突變區(qū)分。另一方面，通過直接比對氨基酸序列，移碼突變?nèi)菀妆话l(fā)現(xiàn)。此外，RNA轉(zhuǎn)錄本的檢測不能對細(xì)胞或組織中的蛋白進(jìn)行定量。在翻譯效率上有許多基因特異的作用，如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括RNA修飾和RNA末端添加polyA尾，能改變RNA的生命周期和蛋白翻譯速率，使得蛋白檢測需要其它明確的方法。

因此，盡管基因組和轉(zhuǎn)錄組測序價(jià)格便宜，但不能解決全部問題。mRNA轉(zhuǎn)錄過程的不同，翻譯后修飾和翻譯后結(jié)構(gòu)的加工只能通過蛋白水平的直接分析來展現(xiàn)，這些對蛋白的研究是迫切需要的。然而，整個(gè)蛋白測序較難完成。蛋白一級結(jié)構(gòu)是氨基酸組成的線性序列，包含20種氨基酸，每個(gè)氨基酸體積約為0.1 nm3，由肽鍵相連。人類蛋白約有375個(gè)氨基酸殘基。因此，上百個(gè)氨基酸需要亞納米級的分辨率來進(jìn)行測序。除了20個(gè)組成蛋白的氨基酸之外，還有些氨基酸異構(gòu)體組成的復(fù)合物對蛋白直接測序構(gòu)成了挑戰(zhàn)。異構(gòu)體源自于緊密相連的重復(fù)基因或者同一個(gè)基因的可替代性剪接、蛋白裂解、體細(xì)胞重組或者翻譯后修飾。據(jù)猜測，蛋白編碼基因約20,000個(gè)，考慮到可替代性剪接，單個(gè)氨基酸多態(tài)性和翻譯后修飾，估計(jì)每個(gè)基因有100個(gè)異構(gòu)體。翻譯后修飾使得蛋白水平的分析較為困難，翻譯后修飾包括糖基化、甲基化、乙?；土姿峄７g后修飾較為常見，如60%的蛋白發(fā)生了糖基化。然而，這些修飾難以被傳統(tǒng)的方法檢測到。

2. 在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之外，利用質(zhì)譜（MS）研究蛋白組學(xué)

20世紀(jì)90年代，主要通過Edman降解法進(jìn)行蛋白測序。在該過程中，苯異硫氰酸酯與N-端氨基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰衍生物，隨后裂解成為噻唑啉酮和一個(gè)新的N-端。釋放的噻唑啉酮氨基酸被固定后，使用電泳或色譜技術(shù)進(jìn)行確定。然后，繼續(xù)重復(fù)該過程。Edman法較為緩慢（1個(gè)循環(huán)花費(fèi)1個(gè)小時(shí)），并且局限于小于30個(gè)殘基的多肽，每個(gè)氨基酸的正確率大于99%。Edman降解法需要100 pmol純肽，不適用于N端無游離α-氨基的氨基酸，不能如實(shí)的測定翻譯后修飾蛋白。

目前，蛋白組學(xué)主要依賴于bottom-up法進(jìn)行蛋白的質(zhì)譜分析（BU-MS）(圖1A)。BU-MS分析涉及到蛋白酶解（通常是胰蛋白酶），多肽離子化，根據(jù)質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行離子檢測。胰蛋白酶解多肽由電噴霧離子化或基質(zhì)輔助激光解析電離，在氣相中進(jìn)行多肽離子化，分析其質(zhì)量，然后將離子破碎，從質(zhì)譜中恢復(fù)序列信息。液相色譜-MS(LC-MS)在離子化前能用來分離化合物，并傳遞給質(zhì)譜儀。

BU-MS實(shí)際上本身不能對蛋白進(jìn)行測序，但是能推斷出蛋白一級結(jié)構(gòu)或者對蛋白進(jìn)行分類，這種方法不太敏感。多肽質(zhì)量作為“指紋”，使用Mascot或Sequest數(shù)據(jù)庫能將其與蛋白數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白進(jìn)行關(guān)聯(lián)。因?yàn)橐恍┌被峋哂邢嗤馁|(zhì)量（如亮氨酸和異亮氨酸），所以將序列同源搜索與數(shù)據(jù)庫查找相結(jié)合。BU-MS的缺點(diǎn)是蛋白被鑒定前首先需要被消化成5-20個(gè)氨基酸組成的多肽。接下來，數(shù)據(jù)庫搜索比對一些片段到整個(gè)蛋白，這一步受限于蛋白之間的序列同源性或相似性。最后，將多肽序列比對到特殊的蛋白是由將多肽比對所有可能的相關(guān)蛋白，在重構(gòu)前通過排除多余肽段或者找到所有的揭示這些現(xiàn)象的最小蛋白集完成。

BU-MS的敏感性是指準(zhǔn)確鑒定多肽序列所需要的光譜數(shù)。Gris指出，由于信噪比低、數(shù)據(jù)庫的不完整和預(yù)料不到的翻譯后修飾，蛋白收集到的75%的光譜仍未得到鑒定。使用聚類法能將20%的光譜得到鑒定，但有60%的仍未解決。因此，BU-MS確定的肽段數(shù)目有限，不能測定全序列。與基因組學(xué)相比，MS具有高通量、準(zhǔn)確性高和具有再現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)，但具有敏感性低和讀長短的缺點(diǎn)。

敏感性是最重要的，典型的質(zhì)譜檢測限約480 fg，相當(dāng)于10 amol或6百萬, 50 kDa（50 kDa是人類蛋白組的平均分子量）的蛋白分子。敏感性低導(dǎo)致動態(tài)范圍有限。動態(tài)范圍是檢測可測肽段或蛋白信號的標(biāo)準(zhǔn)。在含有大量肽段時(shí)，動態(tài)范圍高時(shí)能檢測到豐度較少的肽段。MS中的商業(yè)雜交軌道阱動態(tài)范圍有5個(gè)數(shù)量級(Thermo Fisher Scientific)，然而，一個(gè)臨床樣本的蛋白濃度能擴(kuò)展到12個(gè)數(shù)量級。例如，在人類血清中，抗體濃度為mg/ml，然而細(xì)胞因子的濃度為pg/ml。在細(xì)胞外液中低分子量的細(xì)胞因子作為血清生物標(biāo)志物的主要靶標(biāo)。但是因?yàn)槠渚哂懈呱锘钚?，如果不進(jìn)行富集或者分級，他們的濃度低到無法被MS檢測，尤其是在人類血清中。實(shí)際上，不到1%的離子被應(yīng)用于質(zhì)量分析，然而，“Boxcar”法能通過質(zhì)荷比分離樣品，提高了這一部分，因此動態(tài)范圍增加了10倍。實(shí)驗(yàn)中的串聯(lián)質(zhì)譜像多反應(yīng)檢測和抗體富集的敏感性增強(qiáng)了10,000-100,000倍，然而，鑒定通常需要一百萬到十億個(gè)蛋白拷貝。

即使正確地識別了多肽，尋找和發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體，特別是翻譯后修飾蛋白的檢測和定位，仍然是一個(gè)問題。MS已經(jīng)通過離子交換、固定化親和色譜等富集策略捕獲翻譯后修飾蛋白，但是很難捕捉。缺陷包括質(zhì)量測定不準(zhǔn)確，與替代氨基酸混淆，以及位點(diǎn)分配不確定。根據(jù)Liu等人的研究，提高質(zhì)量測量精度(MMA)可以減少組成肽段的可能的氨基酸數(shù)量。例如，對于高可信度的鑒定，MMA為百萬分之一(ppm)可以排除99%具有相同質(zhì)量但不同的氨基酸。而線性離子阱MS的MMA為100-250 ppm，因此，一部分蛋白可能會被錯(cuò)誤識別。另一方面，軌道阱是MS的主要設(shè)備，根據(jù)制造商的規(guī)范，它的MMA <10 ppm，但是對于解釋軌道阱的數(shù)據(jù)，它的MMA可達(dá)50 ppm。除了MMA，位點(diǎn)不確定性尤其成問題。Kim等人的研究表明，這個(gè)問題可以通過考慮磷酸化來簡明地說明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要修飾主要發(fā)生在絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸殘基上。在人類蛋白組中大約有2000萬個(gè)殘基，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸殘基的數(shù)量大約分別是150萬，100萬和50萬。對于10個(gè)氨基酸長度的胰蛋白酶肽，大約有1.5個(gè)磷酸化位點(diǎn)。換句話說，在其多肽內(nèi)部有多個(gè)可能的磷酸化位置。所以，位點(diǎn)被統(tǒng)計(jì)分配。但是，對于大約一半的多肽，PTM的位點(diǎn)定位是有問題的，或者，使用BU-MS需要有PTM的知識。這一問題可以通過替代分離技術(shù)解決，但需要更多的樣本，并排除了對修飾組合模式的明確檢查。

另一方面，TD-MS可識別完整的蛋白，并可檢測序列變異或?yàn)闇y序提供一個(gè)支架，但其敏感性比BU-MS低約100倍，它需要大磁體(7到14 T)，在蛋白組覆蓋率和通量方面通常低于BU-MS(圖 1B)。TD-MS分析通過電噴霧電離將完整的蛋白離子引入氣相，然后通過質(zhì)譜儀中碰撞誘導(dǎo)分離、或電子捕獲離解或電子轉(zhuǎn)換離解進(jìn)行片段化，產(chǎn)生蛋白和碎片離子。如果有足夠的片段，這種分析可以提供蛋白一級結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)修飾的全面圖像。然而，如果蛋白分子大于50-70 kDa，則很難使完整蛋白離子在氣相中片段化。它需要一個(gè)相對高端的設(shè)備來解決相似體積的大分子之間的差異。賴氨酸三甲基化和乙?；g的質(zhì)量差異僅為0.0364 Da。對于一個(gè)平均為50 kDa的人類蛋白，識別一個(gè)完整的蛋白離子需要設(shè)備分辨率<1 ppm。然而，對于1 kDa片段，所需的分辨率< 37 ppm。帶有7-T磁鐵的線性四極離子阱/傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀的質(zhì)量精度只有2 ppm，而使用軌道阱的碰撞誘導(dǎo)離解碎片時(shí)，典型的質(zhì)量精度為<10 ppm。

根據(jù)Steen和Mann，MS對蛋白的靈敏度和檢測限比對多肽差得多。隨著分子量的增加，完整蛋白的碎裂效率因?yàn)槿壗Y(jié)構(gòu)的復(fù)雜性而降低。因此，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大的蛋白則需要高純度和高濃度(0.5-1 mg/ml)。所以，大多數(shù)TD的應(yīng)用程序致力于質(zhì)量<70 kDa的蛋白，只有少數(shù)用于更大的蛋白（>100 kDa）。

因此，人類蛋白組中直接鑒定整個(gè)蛋白需要的是一個(gè)具有高通量、高準(zhǔn)確度和敏感度的方法。理想情況下,該方法將直接“讀取”氨基酸序列、PTMs和異構(gòu)體的一級結(jié)構(gòu)，而不需要通過搜索數(shù)據(jù)庫。

圖1 MS推斷蛋白一級結(jié)構(gòu)

MS采用兩種方法推斷蛋白的一級結(jié)構(gòu)：（A）bottom-up (BU-MS) （B）top-down (TD-MS)法分析<70 KDa的完整蛋白。BU-MS的流程為：蛋白首先經(jīng)過胰蛋白酶消化，產(chǎn)生1.8-3 kDa的片段，再進(jìn)行MS分析。TD-MS能將完整的蛋白離子再氣相中片段化（平均10 kDa）并使用MS分析整個(gè)蛋白和蛋白離子片段。這兩種方法都離不開數(shù)據(jù)庫搜索對蛋白進(jìn)行鑒定。CID,碰撞誘導(dǎo)解離; ECD, 電子捕獲分離; ETD, 電子轉(zhuǎn)移解離。