編譯：冬日暖陽(yáng)，編輯：十九、江舜堯。
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天然酚類(lèi)化合物通常存在于植物中，并構(gòu)成最大的植物化學(xué)物質(zhì)。多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，可分為不同的組，例如酚酸，類(lèi)黃酮，單寧，對(duì)苯二酚和木脂素。這些化合物具有不同的作用，例如信號(hào)分子，植物防御劑和植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸調(diào)節(jié)劑。另外，由于它們的抗氧化活性和清除自由基的能力，已經(jīng)對(duì)這些化合物進(jìn)行了充分的研究。它們還具有多種健康益處，例如抗炎，抗菌，抗增殖，抗癌，抗氧化特性。 苯酚酸是芳香族羧酸的羥基衍生物，廣泛分布于植物中，分為兩類(lèi)：羥基苯甲酸衍生物和羥基肉桂酸衍生物。酚酸是通過(guò)苯丙烷途徑在植物中產(chǎn)生的。這些是monolignol途徑的副產(chǎn)物，是維管植物中木質(zhì)素和細(xì)胞壁聚合物的分解產(chǎn)物。植物中酚酸合成中涉及的兩個(gè)主要氨基酸包括苯丙氨酸和較小程度的酪氨酸。脫氨基，羥化和甲基化是酚酸形成的三個(gè)主要反應(yīng)。首先，發(fā)生苯丙氨酸和/或酪氨酸的脫氨基反應(yīng)，分別產(chǎn)生肉桂酸和/或?qū)ο愣顾?，肉桂酸和?duì)香豆酸的芳環(huán)然后被羥基化和甲基化以形成其衍生物阿魏酸和咖啡酸。此外，這些酚酸含有C6-C3結(jié)構(gòu)，并被用作木質(zhì)素和其他酚類(lèi)化合物的合成前體，關(guān)于酚酸生物合成的知識(shí)比關(guān)于類(lèi)黃酮和單木酚的知識(shí)少，迄今為止，該途徑的許多步驟仍然未知。最近，酚酸受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，大多數(shù)植物酚類(lèi)研究集中在檢查蔬菜和水果中的這些化合物。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可提供有關(guān)組織生化狀況的大量信息，對(duì)其解釋可提供可用于基因功能表征的有效方法。此外，代謝組學(xué)分析可以被視為關(guān)聯(lián)分析的技術(shù)手段。結(jié)合其他數(shù)據(jù)，可用于分析目標(biāo)代謝途徑中涉及的基因功能，還可為基因挖掘提供支持信息。高通量測(cè)序，高分辨率質(zhì)譜和信息處理技術(shù)的最新發(fā)展和應(yīng)用對(duì)于探索主要生物學(xué)現(xiàn)象的系統(tǒng)生物學(xué)研究已變得不可或缺。轉(zhuǎn)錄物和代謝物數(shù)據(jù)集通過(guò)相關(guān)性和聚類(lèi)分析進(jìn)行了組合，可以表示為基因與代謝物之間的連接網(wǎng)絡(luò)，可以揭示水稻對(duì)夜間溫度升高的響應(yīng)機(jī)制，這是花朵中飛燕草素的調(diào)節(jié)機(jī)制。葡萄風(fēng)信子的顏色，馬鈴薯的色素沉著機(jī)理，睡蓮的藍(lán)花形成機(jī)理和白化茶品種“玉金香”的兒茶素生產(chǎn)。此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的整合為確定關(guān)鍵代謝途徑的生物合成機(jī)制提供了顯著優(yōu)勢(shì)。迄今為止，尚未通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的組合分析研究酚類(lèi)化合物的生物合成。Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja是Cyclocarya的唯一種，在中國(guó)俗稱(chēng)“甜茶樹(shù)”，被用作中藥。它廣泛分布于中國(guó)的亞熱帶地區(qū)。在中國(guó)，傳統(tǒng)上將青錢(qián)柳用作保健食品已有1000多年的歷史。青錢(qián)柳的葉子已被用作功能食品或保健茶，用于治療多汗癥，高血壓和糖尿病。2013年，中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)已將青錢(qián)柳葉片批準(zhǔn)為新的食品原料。有人提出，青錢(qián)柳葉片中的生物活性物質(zhì)是其治療作用的原因。由于其各種健康益處，需要大量生產(chǎn)假單胞菌葉子。尚未對(duì)不同發(fā)育階段的青錢(qián)柳葉片中酚酸的積累和酚酸生物合成基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。本研究采用綜合的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)研究酚酸含量的變化以及參與酚酸合成途徑的不同表達(dá)基因的變化，旨在發(fā)現(xiàn)：酚酸合成途徑和在不同發(fā)育階段的青錢(qián)柳葉片中酚酸合成的調(diào)控機(jī)制。
論文ID
原名：Combined Analysis of the Metabolome and Transcriptome Identified Candidate Genes Involved in Phenolic Acid Biosynthesis in the Leaves of Cyclocarya paliurus
譯名：代謝和轉(zhuǎn)錄組組合分析鑒定青錢(qián)柳葉片中參與酚酸生物合成的候選基因
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.32
發(fā)表時(shí)間：2020.02
通訊作者：李俊民
通訊作者單位：臺(tái)州學(xué)院浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
DOI號(hào)：10.3390/ijms21041337
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
結(jié)果
1.不同發(fā)育階段青錢(qián)柳葉片中酚酸生物合成基因的表達(dá)
基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的苯丙烷類(lèi)生物合成，基于檢測(cè)到的代謝物構(gòu)建了青錢(qián)柳葉片的酚酸合成途徑，共鑒定出58個(gè)基因參與酚酸的生物合成途徑（圖2A）。通過(guò)四個(gè)開(kāi)發(fā)階段的比較，共鑒定出10個(gè)DEG，包括一個(gè)PAL基因，一個(gè)C4H基因，一個(gè)F5H基因，一個(gè)COMT基因，兩個(gè)UGT72E基因，一個(gè)HCT基因和一個(gè)咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（圖2B）。兩個(gè)DEG的表達(dá)隨著發(fā)育階段的進(jìn)展而降低，并且基因表達(dá)在F1階段最高。在F2階段，只有一個(gè)DEG的表達(dá)先上升然后下降，并且最高。其他DEGs遵循不同的表達(dá)趨勢(shì)，但是在F4階段它們的所有基因表達(dá)水平最高。酚酸生物合成途徑共涉及22個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF），包括12個(gè)MYB TF和10個(gè)基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）TF（圖2C）。
圖1 青錢(qián)柳酚酸生物合成通路。
圖2 酚酸生物合成通路基因熱圖（A），酚酸生物合成通路基因的差異表達(dá)情況（B），MYB、bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因熱圖（C）。
2.酚酸生物合成通路中代謝產(chǎn)物的鑒定
共檢測(cè)到14種涉及酚酸生物合成途徑的代謝物，包括6種酚酸（肉桂酸，咖啡酸，綠原酸，阿魏酸，芥子酸和對(duì)香豆酸）（表1）。差異累積代謝物（DAM）的定義是葉片發(fā)育階段之間倍數(shù)變化≥2或倍數(shù)變化≤0.5且項(xiàng)目重要性（VIP）≥1的變量。檢測(cè)到八個(gè)DAM，包括兩種酚酸（對(duì)香豆酸，芥子酸），其他代謝物被鑒定為丁香精，松柏素，芥子醇，芥子酸蘋(píng)果酸，L-苯丙氨酸和松柏醇。 DAM的含量在四個(gè)發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)，但所有八個(gè)代謝產(chǎn)物的含量在F4階段最高。
表1 酚酸生物合成通路中的代謝物含量及種類(lèi)
3.代謝組、轉(zhuǎn)錄組綜合分析
為量化基因與代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，作者通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析將轉(zhuǎn)錄組和代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)一體化，并建立了量化轉(zhuǎn)錄本-代謝物關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)。代謝物和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)log2函數(shù)變換，然后進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。引入該分析中的配對(duì)要求Pearson關(guān)聯(lián)系數(shù)（PCC）≥0.9、p<0.05。共鑒定出64個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)，使用Cytoscape軟件（3.6.1版本）將它們可視化?？梢暬W(wǎng)絡(luò)顯示，共有47個(gè)節(jié)點(diǎn)，由64條邊連接。這47個(gè)節(jié)點(diǎn)包括了32個(gè)基因和15個(gè)代謝物。43對(duì)為正相關(guān)，21對(duì)為負(fù)相關(guān)（圖3）。在酚酸生物合成中，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)候選DEG，包括PAL (TRINITY_ DN87383_c2_g1)、C4H (TRINITY_DN83539_c2_g6)、CAD(TRINITY_DN92541_c0_g1)、COMT (TRINITY_DN95472_c1_g2)、HCT (TRINITY_DN97112_c1_g2)和UGT72E (TRINITY_ DN93270_c1_g1)。上述結(jié)果表明，參與酚酸生物合成的某些DEG與對(duì)應(yīng)的代謝物有高度關(guān)聯(lián)性。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證了代謝組數(shù)據(jù)的可靠性、精確性。
圖3 不同發(fā)育階段搖錢(qián)樹(shù)葉片中結(jié)構(gòu)基因和酚酸生物合成通路代謝物的共表達(dá)分析。
4.參與酚酸生物合成轉(zhuǎn)錄因子的篩選和系統(tǒng)發(fā)育分析
為系統(tǒng)地鑒定操控青錢(qián)柳不同發(fā)育階段葉片中酚酸生物合成的未知假定轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)代謝通路基因和差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了共表達(dá)分析。以前期篩選出的6個(gè)酚酸生物合成基因（編碼PAL、C4H、CAD、COMT、UGT72E、HCT的基因）作為“引導(dǎo)基因”，鑒定共表達(dá)特異關(guān)系。通過(guò)與PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比較，共鑒定出386個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。在引導(dǎo)基因和差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，配對(duì)要求PCC≥0.9、p<0.05。共鑒定出44對(duì)關(guān)聯(lián)配對(duì)，并使用Cytoscape軟件將其可視化?？梢暬W(wǎng)絡(luò)顯示，414條邊將134個(gè)節(jié)點(diǎn)連接，包括6個(gè)引導(dǎo)基因和128個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（圖4）。在已鑒定的共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中（p<0.05），MYB、bHLH、ERF家族成員是正相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子中最多的成員。
由于MYB和bHLH是參與酚酸生物合成的兩個(gè)最重要轉(zhuǎn)錄因子，所以青錢(qián)柳的MYB和bHLH基因被分別用于和擬南芥R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子、擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。12個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子分為6枝，TRINITY_DN86884_c1_g7、TRINITY_DN92774_c0_g3、TRINITY_DN89360_c1_g9、 TRINITY_DN91730_c2_g1、TRINITY_ DN97533_c2_g5 基因顯示出與AtMYB39、AtCDC5、AtMYB91的同源性，它們聚為最大一枝。
參照KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)苯丙素生物合成方法（圖5），構(gòu)建青錢(qián)柳葉片中酚酸合成通路。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建綜合了所有代謝物、基因、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)果，以直觀表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因表達(dá)、基因表達(dá)、代謝物累積之間的關(guān)系。轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的增強(qiáng)子結(jié)合，因此，假設(shè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的增強(qiáng)子上從而激活基因表達(dá)，包括代謝物積累。包括PAL、C4H、CAD、COMT、HCT等酚酸生物合成通路中的結(jié)構(gòu)基因受到許多MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。所有經(jīng)由關(guān)聯(lián)性分析篩選出的MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子都顯示出相似的表達(dá)趨勢(shì)，而且在F4階段高表達(dá)，這種情形與多數(shù)差異表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因很相似（圖2C）。特別地，本研究得到了12個(gè)MYB、10個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子、10個(gè)差異表達(dá)結(jié)構(gòu)基因作為候選基因。它們可以被用于研究青錢(qián)柳葉片不同發(fā)育階段酚酸生物合成背后的調(diào)控機(jī)制。
6.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的RT-qPCR驗(yàn)證
使用qRT-PCR分析青錢(qián)柳中參與酚酸生物合成的酶和轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄豐度。根據(jù)4個(gè)發(fā)育階段基因表達(dá)水平的差異，篩選出18個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR，包括6個(gè)結(jié)構(gòu)基因（PAL、C4H、HCT、CAD、COMT和UGT72E）、6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子和6個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子。18個(gè)基因與RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中的表達(dá)模式相似（圖6）。因此，本研究數(shù)據(jù)可用于研究青錢(qián)柳中的酚酸生物合成和代謝相關(guān)基因。
圖4 青錢(qián)柳葉片中酚酸生物合成通路結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)分析。黃色節(jié)點(diǎn)為MYB轉(zhuǎn)錄因子。綠色節(jié)點(diǎn)為bHLH轉(zhuǎn)錄因子。亮藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為CO樣轉(zhuǎn)錄因子。藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（ERF）。粉紅色節(jié)點(diǎn)為種類(lèi)激活物樣效應(yīng)器（TALE）轉(zhuǎn)錄因子。橙色節(jié)點(diǎn)為NAC（NAM、ATAF、CUC）轉(zhuǎn)錄因子。灰色節(jié)點(diǎn)為其他轉(zhuǎn)錄因子。紅色邊為正相關(guān)，綠色邊為負(fù)相關(guān)。
圖5 青錢(qián)柳不同發(fā)育階段葉片中酚酸生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。紅色框?yàn)闄z測(cè)到的代謝物。實(shí)線框?yàn)橐徊竭^(guò)程，虛線框?yàn)槎嘤谝徊竭^(guò)程。黑色箭頭為MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能的方向。粉色箭頭為酚酸生物合成方向。
圖6 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）驗(yàn)證RNA測(cè)序中參與酚酸生物合成候選的unigene。直方圖顯示實(shí)時(shí)PCR測(cè)得的相對(duì)基因表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄組中每一百萬(wàn)個(gè)比對(duì)碎片中的TPM以折線圖表示。左側(cè)y軸為實(shí)時(shí)PCR測(cè)得的相對(duì)基因表達(dá)量。
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